廣東惠州地區新生兒5000例應用串聯質譜技術篩查遺傳代謝病的結果及跟蹤隨訪分析

張志強 趙雨香 曾業熙

【摘要】 目的：觀察廣東惠州地區新生兒5 000例應用串聯質譜技術（tandem mass spectrometry，MSMS）篩查遺傳代謝病的結果，進行跟蹤隨訪分析。方法：選取廣東惠州地區新生兒5 000例為研究對象，以MSMS篩查其遺傳代謝病，并對確診病例進行跟蹤隨訪分析。結果：5 000例新生兒中，篩查出陽性106例（2.12%），最后確診16例，陽性發生率1︰313，其中男11例，女5例，包括氨基酸代謝異常10例，有機酸代謝異常4例，脂肪酸代謝異常2例。MSMS篩查靈敏度100%，特異度98.19%，假陽性率1.81%;跟蹤隨訪平均10個月，其中12例[9例（56.25%）氨基酸代謝異常、2例（12.50%）脂肪酸代謝異常及1例（6.25%）有機酸代謝異常]未表現出顯著癥狀;楓糖尿癥、戊二酸血癥Ⅰ型、甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥者均具有智力發育遲緩與運動能力發育滯后表現;鳥氨酸氨甲酰磷酸轉移酶缺乏者產生嗜睡、抽搐癥狀與高氨血癥。結論：MSMS篩查新生兒遺傳代謝病靈敏度及特異度均較高，但同時存在一定程度假陽性率，有待進一步改進。

【關鍵詞】 廣東惠州 新生兒 串聯質譜技術 遺傳代謝病

[Abstract] Objective： To observe the screening results of inherited metabolic diseases by tandem mass spectrometry （MSMS） from 5 000 newborns in Huizhou， Guangdong， and to conduct follow-up analysis. Method： A total of 5 000 newborns in Huizhou， Guangdong were enrolled as subjects. The inherited metabolic diseases were screened by MSMS. The confirmed cases were followed up and analyzed. Result： Among 5 000 newborns， there were 106 cases （2.12%） positive， and 16 cases finally confirmed， the positive incidence rate was 1︰313. There were 11 males and 5 females， included 10 cases with abnormal amino acid metabolisms， 4 cases with abnormal organic acids metabolism， and 2 cases with abnormal fatty acid metabolism. The sensitivity， specificity and false positive rate of MSMS screening were 100%， 98.19% and 1.81%， respectively. The duration of follow-up was 10 months， there were 12 cases [9 cases （56.25%） with amino acid metabolism abnormalities， 2 cases （12.50%） with fatty acid metabolism abnormalities and 1 case （6.25%） with organic acid metabolism abnormalities] not showed significant symptoms. There were manifestations such as mental development retardation and motor ability retardation in patients with maple syrup urine disease， glutaric aciduria Ⅰ， methylmalonic acidemia with homocysteine. The patients with lack of ornithine carbamoyl phosphate transferase were easily accompanied with drowsiness， convulsions and hyperammonemia. Conclusion： The sensitivity and specificity of MSMS are high for screening neonatal inherited metabolic diseases， but at the same time， there is a certain degree of false positive rate， which needs further improvement.

[Key words] Huizhou， Guangdong Newborn Tandem mass spectrometry Inherited metabolic disease

First-authors address： Huizhou Second Maternal and Child Health and Family Planning Service Center， Huizhou 516001， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.30.021

遺傳代謝病主要指因基因突變使得糖、微量元素、蛋白以及脂肪代謝反應中重要載體或者酶分子等缺失導致的疾病，一般是單基因遺傳病。現階段，常見遺傳代謝病高達500種，新生兒總體患病率約為1︰3 000，若依據中國每年出生1 500萬新生兒進行計算，每年遺傳代謝病患兒有5 000例，其中每天新增例數為14例左右[1-3]。該類疾病對新生兒造成嚴重危害，通常能引起智力障礙，甚至危及生命。早期診治，特別是癥狀產生前的有效篩查，對遺傳代謝病患兒預后意義重大[4]。當前，日本、美國以及德國等國家已經在遺傳代謝病篩查中采取了用串聯質譜技術（tandem mass spectrometry，MSMS）。本文以5 000例新生兒為研究對象，探討MSMS對其遺傳代謝病篩查結果及隨訪情況。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3月-2018年4月廣東惠州地區新生兒5 000例。（1）納入標準：①新生兒父母為本地常住人口;②活產兒;③家屬同意行MSMS篩查。（2）排除標準：可疑陽性，但由于各種原因未參與確診試驗者。其中男2 714例，女2 286例;出生體重1 500～2 500 g 198例，>2 500 g 4 802例;早產兒212例，足月兒4 788例，本研究經本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 依據《新生兒疾病篩查技術規范（2010年版）》相關要求，在嬰兒出生72 h后，于腳跟內、外側進行采血，然后滴于903特殊濾紙片待其自然晾干，最后置于2～8 ℃冰箱之中保存，注意于1周內及時送檢。

1.2.2 檢測方法 采用三重四級桿質譜儀（型號：API 3200MDTM，購自AB Sciex Pte.Ltd）;從干血濾紙中選取圓形濾紙血片，直徑長為3 mm，放在96孔聚丙烯板之內，琥珀酰丙酮和非衍生化多種氨基酸、肉堿測定試劑盒及相關質控樣品購自廣州市豐華生物工程有限公司（注冊證號：國械注準20163401324）。對于檢測項目，主要為10個氨基酸、24個酰基肉堿及其對應具體比值。

1.2.3 檢測數據分析 通過多反應監測掃描方法得到數據，并以配套分析軟件處理后得到各目標代謝物具體絕對值濃度。對于截斷值確定，需依據10 000例正常新生兒予以截斷值計算，規定實驗室獲取值第0.1以及第99.9個百分位值組成的區間是該實驗室指標正常參考水平范圍，相關截斷值依據樣本變化不斷修正，如果分析物>截斷值，則需重新操作1次，如果仍然較高，則需2～3周復查。MSMS陽性標準：分析物嚴重高于截斷值，立即召回予以再次檢查之后，檢查結果依然為同一指標嚴重高于截斷值，則可判斷為陽性，并歸為可疑患者;陰性標準：分析物低于截斷值[5]。

1.2.4 可疑患者確診試驗 對MSMS檢測陽性者予以血常規、生化、尿有機酸、血糖、血氨、尿酮體、乳酸、丙酮酸以及同型半胱氨酸檢查，同時開展血氣分析以及基因分析，完成確診試驗。對確診患兒進行跟蹤隨訪。可疑患者確診診斷標準：（1）氨基酸代謝異常疾病依據《新生兒疾病篩查技術規范（2010年版）》進行評估：對高苯丙氨酸血癥（檢測顯示血苯丙氨酸水平持續超過120 ?mol/L）予以尿蝶呤譜分析以及二氫蝶啶還原酶（DHPR）分子活性測定予以鑒別診斷，其中高苯丙氨酸血癥確定排除BH4缺乏癥后，如果血苯丙氨酸水平≥360 ?mol/L，則診斷為苯丙酮尿癥，如果血苯丙氨酸水平<360 ?mol/L，則診斷輕度高苯丙氨酸血癥。（2）脂肪酸代謝障礙：對于原發性肉堿吸收障礙，需要參考MSMS里面血漿肉堿水平變化情況，若持續明顯降低，則可確診。（3）有機酸代謝障礙疾病通過尿氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）加以明確診斷，戊二酸血癥Ⅰ型：戊二酰肉堿增高，并且戊二酰肉堿/辛酰肉堿結果提升，游離肉堿減少，經基因分析，發現GCDH 2個等位基因具有致病突變;甲基丙二酸血癥：尿同型胱氨酸檢測均顯示存在過量含硫氨基酸。

1.3 觀察指標 觀察總體篩查結果，以確診結果作為對照，分析MSMS檢測準確性、靈敏度與特異度;觀察脂肪酸、氨基酸與有機酸代謝異常檢出情況，并分析隨訪情況。

1.4 統計學處理 使用SPSS 19.0分析數據，計數資料以率（%）表示。

2 結果

2.1 總體篩查結果 5 000例新生兒中，篩查出陽性106例（2.12%），最后確診16例，陽性發生率1︰313，其中男11例，女5例，包括氨基酸代謝異常10例，有機酸代謝異常4例，脂肪酸代謝異常2例。MSMS篩查靈敏度100%，特異度98.19%，假陽性率1.81%。見表1。

2.2 氨基酸代謝異常 本次確診患者中，氨基酸代謝異常10例，包括高苯丙氨酸血癥5例，精氨酸血癥、楓糖尿癥、鳥氨酸氨甲酰磷酸轉移酶缺乏、瓜氨酸血癥以及瓜氨酸血癥Ⅱ型患者各1例。

2.3 有機酸代謝異常 本次確診患者中，有機酸代謝異常4例，包括戊二酸血癥Ⅰ型、甲基丙二酸血癥、甲基丙二酸合并丙酸血癥以及甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥患者各1例。

2.4 脂肪酸代謝異常 本次確診患者中，脂肪酸代謝異常新生兒2例，均存在原發性肉堿吸收障礙。

2.5 跟蹤隨訪分析 16例確診新生兒，平均跟蹤隨訪時間為10個月，其中12例[9例（56.25%）氨基酸代謝異常、2例（12.50%）脂肪酸代謝異常以及1例（6.25%）有機酸代謝異常]未表現出顯著癥狀。楓糖尿癥、戊二酸血癥Ⅰ型、甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥者具有智力發育遲緩與運動能力發育滯后表現;鳥氨酸氨甲酰磷酸轉移酶缺乏者產生嗜睡、抽搐癥狀與高氨血癥。

3 討論

遺傳代謝病屬于對嬰幼兒身體健康造成嚴重危害的疾病，因為疾病種類繁多，新生兒單一疾病發病率不高，在醫療資源較為有限背景下，國家通過進行公共衛生立法，將發病率較高、影響嚴重、早期發現且給予治療后可以取得良好預后的相應疾病納入各地區新生兒群體篩查，同時獲得了較為良好社會效益[6-8]。我國各地區由于經濟發展、醫療水平以及疾病發生情況均存在差異，需對新生兒遺傳代謝病篩查力度與疾病種類予以不同程度增加[9]。

從20世紀60年代Niu等[10]首先實施細菌抑制法進行苯丙酮尿癥臨床篩查以來，不少國家均已在一定程度上實施了遺傳代謝病相關篩查工作。以往常用疾病篩查手段包括時間分辨熒光分析法、細菌抑制法、酶聯免疫檢測法與熒光法等，只能在1次實驗中進行1種疾病檢測，但是遺傳代謝病屬于病種較多疾病，如果使用這些篩查手段，不僅會明顯增加工作量，同時還會降低篩查效率。隨著醫療技術持續發展，新生兒疾病篩查工作中的病種也逐漸增多，特別是MSMS技術的實施，明顯擴展了既往篩查疾病譜，為當前遺傳代謝病篩查工作中最理想的一種分析技術[11-15]。質譜基本原理如下：將分析物離子化，使其成為各種帶電粒子（具有不同質荷比），通過電磁學原理，將這些帶電粒子依據質荷比于空間或者于時間上產生分離，并且排列成圖譜，然后按照圖譜與離子峰值情況對分析物予以鑒定、定量[16-17]。所謂MSMS，即串聯兩臺質譜儀，其中第1臺是分離器，而另1臺為分析儀，能夠分析分析物解離后各種帶電粒子，且其檢測水平能夠達到pg級，能于幾分鐘內完成一個樣本之中幾十個項目的檢測，同時所需樣本量小。遺傳代謝病的出現受胎兒基因與生存環境共同影響，在線人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）顯示，現今已發現遺傳代謝病2萬余種，包括500種左右的常見病，這種疾病在人類出生缺陷中占非常重要的地位[18-19]。

本次研究對廣東惠州地區5 000例應用MSMS篩查的新生兒進行調查分析，發現可疑陽性新生兒106例（2.12%），最后確診16例[氨基酸代謝異常10例（高苯丙氨酸血癥5例，精氨酸血癥、楓糖尿癥、鳥氨酸氨甲酰磷酸轉移酶缺乏、瓜氨酸血癥以及瓜氨酸血癥Ⅱ型患者各1例），有機酸代謝異常4例（戊二酸血癥Ⅰ型、甲基丙二酸血癥、甲基丙二酸并丙酸血癥以及甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥患者各1例），脂肪酸代謝異常2例（原發性肉堿吸收障礙）]，陽性發生率1︰313，與尹峰[20]研究結果相比較高，可能與研究樣本量以及地區差異等相關。與確診結果對照發現，MSMS篩查靈敏度100%，特異度98.19%，假陽性率1.81%，表明MSMS篩查新生兒遺傳代謝病具有較高特異度及靈敏度，但亦具有一定程度假陽性率，需要進一步改進。MSMS技術在新生兒遺傳代謝病篩查過程中具有很多優勢，但其于臨床應用中依然存在不少局限性，包括儀器價格昂貴、維護費用相對較高、必須配備熟悉儀器正確使用方式的相應技術人員;同時，檢測結果較容易受部分藥物或者新生兒體重、孕周與其營養狀況等個體因素影響，需臨床檢查醫師綜合分析檢測結果。因為MSMS篩查的病種通常較少見，需臨床專科醫生熟悉疾病診治過程，并對患兒予以定期隨訪。如果MSMS檢測指標顯示異常，尚無法明確診斷疾病，需結合患者臨床癥狀以及尿GC-MS等其他檢測指標、基因分析、酶活性檢測等確診。對確診新生兒進行跟蹤隨訪，發現其預后情況為：9例氨基酸代謝異常、2例脂肪酸代謝異常以及1例有機酸代謝異常者并未產生明顯癥狀，而其他患者則產生智力發育遲緩、身體運動發育滯后、高氨血癥、嗜睡以及抽搐等表現。

綜上，在新生兒遺傳代謝病篩查中采取MSMS方法，篩查結果靈敏度與特異度非常高，但因存在一定程度假陽性率，故有待進一步改進，該篩查方式可在一定程度上改善患者預后，具有推廣與普及意義。

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（收稿日期：2019-04-22） （本文編輯：程旭然）