出生前PM2.5暴露對(duì)成年期小鼠肝臟纖維化發(fā)生的影響及機(jī)制研究

李政一 施懿宸 徐申亞 王曉珂

【摘要】 目的：探討出生前PM2.5暴露對(duì)成年小鼠肝臟纖維化的影響及其相關(guān)機(jī)制。方法：20只未經(jīng)產(chǎn)的4周齡的SPF級(jí)C57BL/6J雌性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=10）和PM2.5暴露組（n=10），暴露7周之后，按照雌雄2︰1的比例合籠并繼續(xù)暴露至子鼠出生，出生后的雄性子鼠飼養(yǎng)至32周。處死后，觀察出生前PM2.5暴露對(duì)小鼠體重、生化指標(biāo)（TC、TG、AST、ALT）、肝臟組織纖維化及相關(guān)基因表達(dá)（TGF-β1、α-SMA、CollagenⅢ）、氧化應(yīng)激（SOD活性、MAD含量）和炎性指標(biāo)（TLR4和TNF-α）基因表達(dá)的影響。結(jié)果：PM2.5暴露組小鼠出生體重低于對(duì)照組，成年期體重、肝臟組織TG含量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;兩組血清TC、TG、AST、ALT水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;PM2.5暴露組小鼠肝臟組織中TGF-β1、α-SMA、CollagenⅢ的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)灰度值均高于對(duì)照組（P<0.05）;出生前PM2.5暴露組小鼠肝臟SOD活性低于對(duì)照組，肝臟組織MAD含量、TLR4和TNF-α的mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：出生前PM2.5暴露顯著增加小鼠成年期肝臟脂肪酸和膠原蛋白的蓄積，降低肝組織中SOD活性、增加MAD含量及炎性基因的水平，并上調(diào)TGF-β1、α-SMA和Collagen Ⅲ基因的表達(dá)，可通過激活TGF-β1信號(hào)通路誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】 出生前 PM2.5 肝臟纖維化

[Abstract] Objective： To explore the effect of prenatal PM2.5 exposure on liver fibrosis in adult mice and its related mechanism. Method： Twenty four-week-old female SPF C57BL/6J mice were randomly divided into control group （n=10） and PM2.5 exposure group （n=10）. After 7 weeks of exposure， the mice were caged at a ratio of 1︰2 for males and females and continued to be exposed to the birth of their offspring， male offspring were fed for 32 weeks after birth. After death， the effects of PM2.5 exposure on body weight， biochemical indexes （TC， TG， AST， ALT）， liver fibrosis and related gene expression （TGF-β1， α-SMA， CollagenⅢ）， oxidative stress （SOD activity， MAD content） and inflammatory index （TLR4 and TNF-α） gene expression were observed. Result： The birth weight of mice in PM2.5 exposure group was lower than that of control group， the adult body weight and the content of TG in liver tissue were higher than those of control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The levels of serum TC， TG， AST and ALT were compared between the two groups， the differences were not statistically significant （P>0.05）. The mRNA expression levels and the protein expression gray levels of TGF-β1， α-SMA， CollagenⅢ of liver tissue in PM2.5 exposure group were higher than those of control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. SOD activity of liver in PM2.5 exposure group was lower than that of control group， MAD content， TLR4 and TNF-α expression in liver tissue of PM2.5 exposure group were higher than those of control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Prenatal PM2.5 exposure significantly increased the accumulation of fatty acids and collagen in the liver of adult mice， decreased SOD activity， increased MAD content and the level of inflammatory genes， and increased the expression of TGF-β1， α-SMA， CollagenⅢ genes， which could induce liver fibrosis by activating the TGF-β1 signaling pathway.

[Key words] Prenatal PM2.5 Hepatic fibrosis

First-authors address： Department of Occupational Medicine and Environmental Toxicology， School of Public Health， Nantong University， Nantong 226019， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.30.009

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，空氣污染成為目前全球面臨的重要問題。PM2.5作為空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm的細(xì)顆粒物，主要由金屬、鹽分、含碳化合物、揮發(fā)性有機(jī)化合物、多環(huán)芳烴、內(nèi)毒素等化學(xué)和生物成分組成[1-2]。目前，PM2.5對(duì)人體健康的影響已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露與呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)[3]。Li等[4]的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，環(huán)境空氣污染與肝臟脂肪變性呈正相關(guān)。Qiu等[5]的動(dòng)物模型結(jié)果也表明，斷乳后的小鼠PM2.5暴露可以誘導(dǎo)肝臟脂質(zhì)蓄積增加甚至肝臟纖維化的發(fā)生[6]，提示出生后的PM2.5暴露與肝臟損傷密切相關(guān)。生命早期作為機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的窗口期，對(duì)外界的不良環(huán)境因素異常敏感[7]。Bonzini等[8]的流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，孕期PM2.5暴露可導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)以及低出生體重的發(fā)生，而低出生體重通常與成年期的肥胖、糖尿病和肝臟損傷的發(fā)生密切相關(guān)[9]。筆者前期研究結(jié)果也顯示，出生前PM2.5暴露可以誘導(dǎo)子代小鼠成年期肥胖的發(fā)生[10]。肝纖維化作為各種慢性肝病及肝損傷進(jìn)展至肝硬化的中間過程，其實(shí)質(zhì)是肝臟對(duì)各種肝損傷的瘢痕修復(fù)反應(yīng)，然而，當(dāng)肝纖維化一旦進(jìn)展至肝硬化時(shí)，將給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[11]。而出生前PM2.5暴露是否可以導(dǎo)致成年期肝臟纖維化的發(fā)生，目前還沒有相關(guān)的研究報(bào)道。鑒于汽車尾氣顆粒物（diesel exhaust particles，DEP）是PM2.5的重要組分，本研究擬通過咽后壁滴注DEP的方法建立孕前及孕期PM2.5暴露的小鼠模型[12]，觀察出生前PM2.5暴露對(duì)成年期小鼠肝臟纖維化發(fā)生的影響并探討其相關(guān)的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 C57Bl/6J小鼠購(gòu)于南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心;基礎(chǔ)飼料購(gòu)于上海斯萊康公司;DEP（#SRM 2975）購(gòu)買于美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)局（Gaithersburg，Maryland，US）。相關(guān)試劑盒均購(gòu)于中生北控生物科技股份有限公司;Trizol和引物序列購(gòu)于Invitrogen公司;抗體購(gòu)買于cell signaling公司;RT-PCR試劑購(gòu)于Takara公司;熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀LC-480購(gòu)于羅氏公司;全自動(dòng)生化分析儀（AU5831）購(gòu)于貝克曼公司。

1.2 DEP混懸液的配制及使用 根據(jù)城市嚴(yán)重污染下的PM2.5濃度、小鼠的通氣量（24 mL/min）、小鼠和人按體表面積折算的等效劑量比值（9.1），電子天平稱取200 mg DEP粉末并溶解于50 mL的無菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，配制成滴注用DEP混懸液（4 μg/μL），折算出PM2.5的時(shí)間加權(quán)濃度約為211 μg/m3。每次滴注前，混懸液進(jìn)行超聲震蕩30 min，以達(dá)到顆粒物最大程度分散的目的。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及飼養(yǎng) 20只未經(jīng)產(chǎn)的4周齡的SPF級(jí)C57BL/6J雌性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組和PM2.5暴露組，每組10只，均為普通飼料喂養(yǎng)。PM2.5暴露組采用小鼠咽后壁滴注DEP混懸液50 μL（4 μg/μL），每周滴注3次（周一、周三、周五）。暴露7周后兩組均分別按照雌雄2︰1的比例合籠，雄性親代子鼠不接受DEP暴露（F0代雌雄小鼠合籠交配后產(chǎn)生F1代雄性小鼠）。子鼠出生后，每窩留取相同只數(shù)，保證每只母鼠的哺乳數(shù)量一致。斷乳之后，留取雄性子鼠繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)至成年期，每周測(cè)量體重，出生后32周，麻醉處死小鼠。

1.4 觀察指標(biāo) 統(tǒng)計(jì)新生雄性小鼠出生體重、成年期體重，麻醉處死小鼠后計(jì)算新生雄性小鼠肝臟系數(shù)（肝臟重量/體重×100%）;對(duì)照組、PM2.5暴露組分別隨機(jī)抽取10、8只小鼠的肝臟組織檢測(cè)甘油三酯（triglyceride，TG）含量;此外，對(duì)照組、PM2.5暴露組另分別隨機(jī)抽取8、6只小鼠，留取血清用于生化指標(biāo)的檢測(cè)，肝臟組織固定后用于病理切片的觀察，肝臟組織液氮冷凍后用于肝臟組織纖維化相關(guān)基因表達(dá)及蛋白水平的檢測(cè)。

1.4.1 生化指標(biāo)檢測(cè) 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、TG、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）的含量;肝臟組織勻漿之后，分別按照試劑盒說明書檢測(cè)肝臟TG、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。

1.4.2 肝臟組織病理學(xué)觀察 新鮮肝臟組織經(jīng)4%多聚甲醛充分固定后，組織石蠟包埋后連續(xù)切片，切片為5 μm，常規(guī)油紅O和天狼猩紅染色后，觀察肝臟組織的脂肪蓄積和膠原蛋白沉積狀況。

1.4.3 實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)肝臟組織相關(guān)mRAN表達(dá) 按Trizol說明書從小鼠肝臟組織提取總RNA，核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定相關(guān)RNA濃度，在20 μL的反應(yīng)體系中將3.0 μg的RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。自基因庫(kù)查得目的基因核酸序列，設(shè)計(jì)PCR引物。引物序列見表1。

1.4.4 Western-blotting檢測(cè)肝臟組織的相關(guān)蛋白表達(dá) 取小鼠肝臟組織提取蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，1︰1 000稀釋的一抗分別孵育轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TFG-β1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、膠原蛋白Ⅲ（Collagen Ⅲ）和內(nèi)參β-actin，4 ℃過夜，1︰10 000稀釋的二抗孵育1 h，顯色液顯色后用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析儀Tanon-5200拍照，Image J軟件分析蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用t或秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 出生前PM2.5暴露對(duì)小鼠體重和肝臟TG的影響 本研究中，對(duì)照組新生雄性小鼠22只，PM2.5暴露組新生雄性小鼠17只，全部納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì);PM2.5暴露組小鼠出生體重（1.18±0.09）g，低于對(duì)照組的（1.26±0.11）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1A;PM2.5暴露組成年期體重（36.22±0.75）g，高于對(duì)照組的（33.49±1.57）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1B;PM2.5暴露組、對(duì)照組小鼠成年期的肝臟系數(shù)分別為（4.23±0.36）%、（4.20±0.24）%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖1C;PM2.5暴露組肝臟組織TG含量（252.81±62.72）mg/g，高于對(duì)照組的（191.03±48.63）mg/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1D。

2.2 出生前PM2.5暴露對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響 PM2.5暴露組小鼠血清TC、TG分別為（2.20±0.20）、（0.48±0.07）mmol/L，均高于對(duì)照組的（2.07±0.17）、（0.43±0.09）mmol/L，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖2A、B;PM2.5暴露組AST、ALT分別為小鼠血清（109.50±14.73）、（44.28±14.85）IU/L，均高于對(duì)照組的（95.55±17.40）、（40.40±2.63）IU/L，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖2C、D。

2.3 出生前PM2.5暴露對(duì)成年期小鼠肝臟組織纖維化發(fā)生的影響 油紅O染色（×200）和天狼猩紅染色（×400）結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肝臟組織肝索結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，無脂肪變性，匯管區(qū)少量的膠原沉積;出生前PM2.5暴露組小鼠肝索結(jié)構(gòu)紊亂，同時(shí)伴隨著脂肪變性和匯管區(qū)的膠原沉積以及纖維組織增生的現(xiàn)象。見圖3。

2.4 出生前PM2.5暴露對(duì)成年期小鼠肝臟組織纖維化相關(guān)基因表達(dá)及蛋白的影響 對(duì)TGF-β信號(hào)通路相關(guān)因子的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，qRT-PCR結(jié)果顯示：PM2.5暴露組和對(duì)照組小鼠肝臟組織中TGF-β1的表達(dá)水平分別為（2.39±0.91）、（0.97±0.45），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖4A;α-SMA表達(dá)水平分別為（1.99±0.60）、（1.05±0.30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4B;CollagenⅢ的mRNA表達(dá)水平分別為（1.52±0.75）、（1.06±0.38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4C。Western blotting進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果，TGF-β1、α-SMA和Collagen Ⅲ的蛋白表達(dá)見圖5A，PM2.5暴露組小鼠肝臟中TGF-β1、α-SMA、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)灰度值分別為（4.78±0.79）、（2.70±0.69）、（1.39±0.31），均高于對(duì)照組的（0.79±0.02）、（0.48±0.01）、（0.41±0.12），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖5B～D。

2.5 出生前PM2.5暴露對(duì)肝臟組織氧化應(yīng)激和炎性基因表達(dá)的影響 出生前PM2.5暴露組小鼠肝臟SOD活性（75.44±9.72）U/g，低于對(duì)照組的（113.70±44.62）U/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖6A;PM2.5暴露組小鼠的肝臟組織MAD含量（12.94±4.41）nmol/g，高于對(duì)照組（8.25±3.11）nmol/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖6B;PM2.5暴露組小鼠肝臟組織TLR4和TNF-α的mRNA表達(dá)含量分別為（2.71±1.21）、（1.91±0.72），高于對(duì)照組的（1.08±0.42）、（0.98±0.17），差異均有統(tǒng)學(xué)意義（P<0.01），見圖6C、D。

3 討論

肝纖維化的形成的主要原因是由于肝臟受到損害與炎癥反應(yīng)后，肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度增生與異常沉積，導(dǎo)致肝臟內(nèi)膠原組織的增多，使肝臟結(jié)構(gòu)和肝功能產(chǎn)生異常病變。近年來，隨著空氣污染的日益加重，PM2.5和肝臟纖維發(fā)生的關(guān)系也引起了研究者的廣泛關(guān)注。文獻(xiàn)[6，13]發(fā)現(xiàn)，出生后單獨(dú)暴露于PM2.5可誘導(dǎo)小鼠肝臟纖維化的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，出生前暴露于PM2.5同樣可以顯著增加肝臟組織膠原纖維的沉積，導(dǎo)致小鼠成年期肝臟纖維化的發(fā)生，進(jìn)一步證實(shí)PM2.5暴露與肝臟纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。

已有大量研究發(fā)現(xiàn)，靜止期肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化是肝臟纖維化的中心環(huán)節(jié)，激活的肝星狀細(xì)胞的增殖和遷移能量明顯增加，并可發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，成為肌成纖維樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的大量合成，同時(shí)，活化的肝星狀細(xì)胞可分泌各種細(xì)胞因子和趨化因子，這些分泌的信號(hào)分子可進(jìn)一步促進(jìn)HSC細(xì)胞的激活[14-16]。α-SMA是肝星形細(xì)胞活化的標(biāo)志，參與合成Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生[17]。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了各組小鼠肝臟組織α-SMA的表達(dá)，結(jié)果顯示，出生前PM2.5暴露組小鼠α-SMA的表達(dá)高于對(duì)照組（P<0.05），與前期研究結(jié)果一致，提示出生前PM2.5的暴露可程序性調(diào)控α-SMA的表達(dá)，從而誘導(dǎo)肝星形細(xì)胞的活化。

肝星形細(xì)胞的活化機(jī)制非常復(fù)雜，其中TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)通路是調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞活化的主要途徑[18]。TGF-β是一個(gè)龐大的超家族，其中哺乳動(dòng)物TGF-β主要分為TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β1在肝臟中含量最高且具有生物活性[19]。Zheng等[13]研究結(jié)果顯示，PM2.5暴露可以顯著增加巨噬細(xì)胞分泌的TGF-β1的基因和蛋白表達(dá)，本研究也發(fā)現(xiàn)出生前PM2.5暴露組小鼠的TGF-β1的基因和蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組（P<0.05），與前期研究結(jié)果一致，說明TGF-β信號(hào)通路在PM2.5誘導(dǎo)的肝臟纖維化中起著重要的作用。

氧化應(yīng)激和炎性發(fā)應(yīng)是外源性化合物刺激肝臟及其免疫細(xì)胞活化并分泌TGF-β1的主要影響因素[20]。以往研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露之后，肝臟組織的SOD活性降低并伴隨著脂質(zhì)過氧化物的含量升高以及炎性通路因子表達(dá)上調(diào)[13，21]。本研究結(jié)果顯示，出生前PM2.5暴露組小鼠的肝臟SOD活性顯著降低（P<0.05），MDA含量明顯增加（P<0.05），同時(shí)炎性因子的表達(dá)也顯著增加（P<0.05），進(jìn)一步提示氧化應(yīng)激和炎性發(fā)炎可能是PM2.5誘導(dǎo)肝臟纖維化的始動(dòng)因素。肝臟線粒體作為氧化應(yīng)激來源的主要細(xì)胞器，在后續(xù)研究中，筆者將進(jìn)一步探討PM2.5暴露對(duì)肝臟線粒體的影響，以期為肝臟纖維化的防治提供科學(xué)的依據(jù)。

綜上所述，生命早期PM2.5暴露與成年期肝臟纖維化發(fā)生的關(guān)系，同時(shí)通過分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，出生前PM2.5暴露誘導(dǎo)肝纖維化作用的機(jī)制是通過啟動(dòng)肝臟內(nèi)的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，促進(jìn)TGF-β1信號(hào)通路，激活HSCs，增加ECM的合成來發(fā)揮作用的。

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（收稿日期：2019-07-08） （本文編輯：董悅）