丙泊酚在兔股骨頭骨骺缺血再灌注損傷中的作用

徐寧 王麗麗 付士平

(1上海市第八人民醫(yī)院骨科，上海 200235；2蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生院)

股骨頭骨骺壞死是髖脫位治療后的常見并發(fā)癥之一，股骨頭骨骺壞死發(fā)生的時間與先天性髖脫位治療后缺血的時間并不一致，骨骺損傷在恢復(fù)血液供應(yīng)后仍然有加重的現(xiàn)象，認為其與缺血后再灌注損傷有關(guān)〔1〕。研究證明，丙泊酚對肝臟、腦、腎等器官的缺血再灌注損傷有保護作用，然而其是否對股骨頭骨骺缺血再灌注損傷具有保護作用不明確〔2，3〕。本研究以新西蘭兔建立股骨頭骨骺缺血再灌注模型，探討丙泊酚對股骨頭骨骺缺血再灌注的保護作用，分析其保護機制，旨在為缺血再灌注損傷的預(yù)防提供理論支持。

1 資料與方法

1.1實驗動物 1月齡健康新西蘭兔93只，雌雄不限，平均體重(1.1±0.2)kg，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所。

1.2主要試劑 全蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；BCA蛋白定量試劑盒(康肽生物科技北京有限公司)；Western一抗、二抗稀釋液(碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗鼠Bcl-2、Bax單克隆抗體(美國Epitomics公司)；β-actin一抗(Santa Cruz公司)；TUNEL檢測試劑盒(上海銘博生物科技有限公司)；其他試劑均為分析純國產(chǎn)試劑。

1.3主要儀器 超凈工作臺(AIRTECH，蘇州凈化設(shè)備有限公司)，RT-PCR儀(美國BIO-RAD公司)，自動生化分析儀(貝克曼庫爾特AU680)，電生理刺激儀(蘇州市東方電子儀器廠)，精密電子天平(Adventurer 公司，美國)，酶標(biāo)儀(上海安亭科學(xué)儀器廠)，紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠)，雙垂直蛋白電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.4動物分組和股骨頭骨骺缺血再灌注模型的建立 93只新西蘭兔分為模型組(n=45)、丙泊酚組(n=45)和正常組(n=3)。模型組采用完全隨機的方法分為缺血4、8、12 h組，每組15只；3組分別在缺血4、8、12 h再灌注，再灌注后即刻、4、24、72、168 h每組分別處死3只兔。丙泊酚組分組同前，處理上的區(qū)別：僅在缺血前、后加靜脈注射適量丙泊酚處理。依據(jù)Yokota等〔4〕方法，采用髂總動脈阻斷-開放法建立股骨頭骨骺缺血再灌注新西蘭兔模型。選取左側(cè)股骨頭為實驗側(cè)。烏拉坦(20 g/L)麻醉成功后，于下腹部正中入路分離髂總動脈，于兩側(cè)髂總動脈分叉處采用無創(chuàng)血管夾夾閉左側(cè)髂總動脈，不阻斷髂總靜脈。觀察足趾末梢毛細血管充盈情況。丙泊酚組在缺血前 10 min 經(jīng)尾靜脈緩慢注射負荷劑量的丙泊酚(20 mg/kg)，缺血后尾靜脈泵注丙泊酚(20 mg·kg-1·h-1)直至處死。術(shù)后縫合皮膚，肌肉注射青霉素80萬U、2～3 d。

1.5檢測指標(biāo)

1.5.1HE染色 常規(guī)石蠟包埋，取石蠟包埋標(biāo)本，連續(xù)切片，片厚4 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察缺血區(qū)軟骨細胞、骨髓細胞和骨骺骨細胞的形態(tài)學(xué)改變。

1.5.2細胞凋亡檢測 取石蠟包埋標(biāo)本，連續(xù)切片，片厚4 μm，采用TUNEL法標(biāo)記凋亡細胞，10 g/L伊文氏藍襯染。熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，未凋亡細胞呈現(xiàn)紅色，凋亡的細胞核發(fā)出綠色熒光，計算1 000個細胞中的凋亡比例。

1.5.3Western印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白表達水平 取完整股骨頭軟骨，剪刀切碎，提取總蛋白，12%的凝膠分離蛋白質(zhì)，在100 V 1.5 h的條件下利用轉(zhuǎn)膜儀(濕轉(zhuǎn))將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉2 h，洗膜后與稀釋的Bcl-2、Bax單克隆抗體(1∶1 000)過夜結(jié)合，洗模后加入稀釋的二抗，室溫孵育60 min，BeyoECL Plus顯色，凝膠成像和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)收集顯色條帶，運用 Quantity One 軟件進行蛋白條帶數(shù)據(jù)分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件行χ2檢驗或t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1HE染色 正常組軟骨細胞、骨髓細胞和骨骺骨細胞包膜完整，排列整齊，無變性壞死等改變。模型組缺血4、8、12 h，缺血區(qū)部分軟骨細胞、骨髓細胞和骨骺骨細胞發(fā)生核固縮；再灌注4、24、72、168 h，核固縮明顯增多，部分出現(xiàn)核碎裂，并可見少數(shù)核溶解。丙泊酚組軟骨細胞、骨髓細胞和骨骺骨細胞病理損傷核固縮均減輕，但未能恢復(fù)正常。

2.2細胞凋亡情況 正常組骨骺細胞的凋亡率僅為(3.15±0.89)%。模型組和丙泊酚組缺血再灌注4、24、72、168 h后骨骺細胞的凋亡率顯著高于缺血再灌注即刻(P<0.05)。與模型組同時刻相比，丙泊酚組骨骺細胞的凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3Bax/Bcl-2蛋白表達水平 正常組Bax/Bcl-2比值僅為0.16±0.09。模型組和丙泊酚組缺血再灌注4、24、72、168 h，Bax/Bcl-2比值顯著高于缺血再灌注即刻(P<0.05)。與模型組同時刻相比，丙泊酚組Bax/Bcl-2比值顯著降低(P<0.05)。見表2。

表1 各組缺血再灌注后骨骺細胞的凋亡率

與本組即刻相比：1)P<0.05；與同期模型組相比：2)P<0.05；下表同

表2 各組缺血再灌注后Bax/Bcl-2比值

3 討 論

缺血再灌注組織損傷的主要原因之一是缺血再灌注損傷產(chǎn)生的自由基，如活性氧可破壞細胞基礎(chǔ)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)膜和DNA等關(guān)鍵生物分子〔5〕。丙泊酚具有酚羥基結(jié)構(gòu)，可在生物體中作為供氫體與自由基反應(yīng)，故可清除自由基而表現(xiàn)出抗氧化活性〔6〕。

股骨頭缺血性壞死模型的構(gòu)建方法很多，但成功的模型不多。本研究采用夾閉髂總動脈的方法構(gòu)建股骨頭缺血性壞死模型，不破壞局部血管、神經(jīng)，盡可能降低外在因素對股骨頭的干擾，成功阻斷了主要血運，導(dǎo)致大部分缺血。同時，該方法不夾閉髂總靜脈，因此不影響血液回流。HE染色結(jié)果顯示，缺血再灌注早期股骨頭軟骨細胞、骨髓細胞和骨骺骨細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，隨著缺血再灌注時間延長，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)逐漸紊亂，可見核固縮或細胞壞死，表明該方法構(gòu)建的股骨頭缺血性壞死模型對股骨頭組織細胞造成了進一步損傷，與文獻〔7，8〕報道結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，丙泊酚可減輕新西蘭兔股骨頭骨骺缺血再灌注損傷。推測丙泊酚缺血前、后聯(lián)合給藥可顯著增強股骨頭對抗缺血再灌注損傷的能力，從而延長缺血耐受時限，這種保護作用與丙泊酚的抗過氧化反應(yīng)有關(guān)。但丙泊酚的這種保護作用是否直接通過其抗脂質(zhì)過氧化能力尚需進一步分析。余奇勁等〔9〕報道，丙泊酚對兔脊髓缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，并推測該作用機制與抗過氧化反應(yīng)有關(guān)。朱敏等〔10〕報道，丙泊酚對腦缺血再灌注大鼠有腦保護作用，可能與其促進ADAR2蛋白核轉(zhuǎn)位、增加腺苷脫氨酶受體有關(guān)。

細胞凋亡是指細胞通過基因嚴(yán)密調(diào)控的主動的程序性死亡〔11〕。Bcl-2是B細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因，該基因是一個多基因家族，其中Bax和Bcl-2是該家族中的兩個主要成員，前者有促凋亡作用，而后者則有抗凋亡的作用〔12〕。Bax/Bcl-2比值大小可預(yù)示細胞凋亡程度。本研究結(jié)果說明缺血再灌注期間抗凋亡基因Bcl-2的表達受到了抑制，而促凋亡基因Bax表達占優(yōu)勢；丙泊酚的應(yīng)用可改善這一狀態(tài)，這與HE染色檢查結(jié)果一致。

綜上所述，丙泊酚可以減輕兔股骨頭骨骺缺血再灌注誘發(fā)的損傷，其機制可能與促進抗凋亡基因Bcl-2的表達、抑制Bax表達，從而進而減輕細胞凋亡有關(guān)。