干細胞治療宮腔粘連的研究進展

郭 靈， 邵曉雯 綜述， 成佳景， 審校

(1. 南京醫(yī)科大學上海十院臨床醫(yī)學院，南京 211166； 2. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200072)

宮腔粘連(intrauterine adhesion, IUA)，又稱Asherman綜合征(asherman syndrome, AS)，1894年由Heinrich Fritsch首次報道，并于1950年由Joseph Asherman進一步命名[1]，其在女性繼發(fā)不孕中的發(fā)病率高達22%。宮腔粘連的發(fā)生機制目前還不是很清楚，但有研究認為創(chuàng)傷、感染和低雌激素狀態(tài)是引起子宮內膜損傷后修復障礙、導致宮腔粘連發(fā)生的主要危險因素。據(jù)統(tǒng)計，92%的子宮內膜損傷繼發(fā)于流產(chǎn)和產(chǎn)后進行的宮腔操作[1-3]。我國每年有600～1 300萬人次行人工流產(chǎn)術，其中40%會繼發(fā)不同程度的內膜損傷。

子宮內膜層主要由上皮細胞和間質細胞組成。組織學分為功能層和基底層。女性排卵周期中，子宮內膜功能層在激素作用下發(fā)生增生、分泌、脫落，而基底層可生成新的功能層，修復功能層脫落的創(chuàng)面。在排卵期，子宮內膜厚度至少達到7～8mm是保證胚胎正常植入的前提，低于6mm，則妊娠的可能性極低。流產(chǎn)、產(chǎn)后出血和刮宮術等宮腔操作常引起基底層的機械性損傷，若合并生殖道細菌逆行感染，常導致子宮內膜腺上皮細胞、間質細胞再生障礙，新生血管受損，子宮內膜活性喪失，肌層缺乏內膜覆蓋，發(fā)生內膜纖維化和宮腔前后壁粘連，或是子宮內膜呈頑固性不再增生。宮腔鏡下可見內膜厚度不均、局部變薄和粘連。組織病理學表現(xiàn)為宮腔內附著稠厚的纖維組織，纖維組織附著部位殘留少量甚至完全缺乏正常的內膜組織，纖維附著部位的子宮內膜菲薄、腺體萎縮，缺乏有血管的間質，粘連局部處于低氧缺血的微環(huán)境。臨床表現(xiàn)主要為月經(jīng)紊亂、經(jīng)量減少甚至閉經(jīng)、導致胚胎難以著床造成不孕[1-4]。

目前對于宮腔粘連并無治療指南。傳統(tǒng)的治療方案以手術和雌激素聯(lián)合治療為主。先行宮腔鏡檢查明確宮腔粘連及內膜的損傷程度，宮腔鏡下行粘連松解術同時放置機械屏障如宮內節(jié)育器或球囊，術后予以口服雌激素促進子宮內膜再生。但目前文獻顯示這些方法效果均不佳，宮腔粘連患者的治愈率和妊娠率無明顯改善，而且粘連復發(fā)率較高(輕度患者復發(fā)率超過30%，重度患者復發(fā)率超過60%)，很多患者經(jīng)過多次治療后仍以失敗告終。此外，大劑量雌激素的應用使得乳腺癌、卵巢癌等雌激素相關性腫瘤發(fā)病風險升高[5-6]。隨著女性性生活年齡提前，婚前人工流產(chǎn)增加，宮腔粘連的發(fā)病率和檢出率逐年上升，發(fā)病年齡呈年輕化趨勢。宮腔操作繼發(fā)宮腔粘連導致的不孕給婚姻和家庭帶來巨大的負面影響，成為潛在的重大醫(yī)療和社會問題。探索新的有效防治子宮內膜損傷、治療宮腔粘連的方法、恢復因宮腔粘連造成的不孕成為重大而緊迫的社會需求。

近年來，有學者提出導致宮腔粘連的子宮內膜修復障礙與局部干細胞損傷和缺失有關，認為子宮內膜的再生修復源自內膜中的干細胞。子宮內膜創(chuàng)傷和感染時內膜基底層損傷可能使位于此處的子宮內膜干細胞數(shù)量減少甚至缺失、功能受損，子宮內膜腺上皮不能完全再生，導致內膜疤痕性修復，最終引起內膜損傷[7-8]。這一理念的提出突破了傳統(tǒng)的治療手段，為子宮內膜損傷的治療提供了新思路。

1 治療子宮內膜損傷干細胞的種類及研發(fā)現(xiàn)狀

干細胞被定義為可自我復制以及可分化成多種不同種類的細胞，并能夠進一步產(chǎn)生至少一種高度分化后代的未分化細胞群體。人體內的多數(shù)器官和組織都含有干細胞群，在組織受到破壞或老化時提供替代細胞從而維持組織的內穩(wěn)定。

干細胞具有自我復制和分化潛能，在一定的生理和病理誘導下，能夠活化增殖，向同一或不同組織起源的細胞類型分化，維持機體和組織器官的功能、穩(wěn)態(tài)和再生修復，在再生治療中具有巨大的潛力，成為重大疾病防治的研究熱點[9-10]。

2 子宮內膜干細胞

目前，許多實驗團隊都已證明子宮內膜中存在內膜干細胞，可能在每次月經(jīng)周期中激活參與子宮內膜的重建。關于子宮內膜上皮干細胞的身份仍有待探究，目前主要認為它們存在于子宮腺基的基底層血管周圍[11]，包括以下類型。

子宮內膜類間充質干細胞(endometrial mese-nchymal stem-like cells, eMSCs)是集落形成基質細胞中的一個小細胞群，存在于基底層和功能層的血管周圍，共同表達CD146+和血小板衍生生長因子受體β+(PDGF-βR+)。該實驗團隊也首次證實eMSCs可在體內再生形成子宮內膜基質[11-12]。

側群細胞(side population cells, SP cells)因其表達多種內皮細胞標記而被認為是一種內皮干細胞。SP細胞集中于表達CD9-CD13-的子宮內膜部分。這些從子宮內膜中分離出來的SP細胞可產(chǎn)生類腺體(CD9+)或類基質(CD13+)細胞[11-13]。Masuda等[14]證明了SP細胞在特殊介質中可以增殖分化為多種類型的子宮內膜細胞，包括腺細胞、上皮細胞、基質細胞、內皮細胞。他們在動物實驗中，將SP細胞植入免疫缺陷小鼠的腎包膜下，發(fā)現(xiàn)SP細胞可以生成含腺狀結構、基質、血管和肌層的內膜組織，并隨激素的變化而產(chǎn)生增生、分化、脫落的周期性改變。Cervelló等[15-16]亦證實了相同的結果，SP細胞可在小鼠體內產(chǎn)生類內膜樣組織，同時該組織中的內膜腺體可表達孕激素并能夠進一步分化形成蛻膜。

子宮內膜干細胞是具有自我更新、多向分化和高增殖潛能的成體干細胞，并且可以通過搔刮子宮內膜或月經(jīng)血涂片等手段獲得，操作簡單、取材便利，或許能成為多能干細胞的一種新的潛在資源。2016年，Zhang等[17]將來源于月經(jīng)血的eMSCs移植入子宮內膜受損的小鼠體內，發(fā)現(xiàn)內膜厚度及微血管密度增加，子宮內膜的損傷修復速度明顯增加。此外，與內膜損傷的小鼠相比，治療組的生育能力提高，具有較高的受孕率和較大的胚胎數(shù)。2018年，Domnina等[18]在宮腔粘連大鼠模型中植入月經(jīng)血來源的eMSCs，大鼠的生育力顯著提高，與接受骨髓干細胞移植的大鼠相比，其每胎分娩數(shù)量更多。

3 骨髓間充質干細胞

骨髓間充質干細胞(bone marrow derived stem cells, BMDSCs)因其可從骨髓中分離，較易在體外進行培養(yǎng)、誘導和擴增，是目前干細胞移植治療領域應用最為廣泛的一類種子細胞，具有分化為多種類型細胞的能力，可能對受損的組織有一定再生或修復作用，但相關具體機制仍需探究。

研究者發(fā)現(xiàn)接受過男性捐贈者骨髓進行移植的女性患者的子宮內膜細胞中有Y染色體的存在，由此推測BMDSCs也許能形成子宮內膜細胞，后續(xù)研究也進一步證實了移植于子宮內膜的BMDSCs具有分化成為上皮細胞和基質細胞的能力。有研究[19-21]在接受了雄性小鼠血液干細胞移植的雌性小鼠樣本中發(fā)現(xiàn)所有受試雌性小鼠都含有捐贈者來源的子宮內膜干細胞，證明供體BMDSCs都可在受體體內分化成子宮內膜。Dimitrov等[22]也發(fā)現(xiàn)在人子宮內膜中含有少量具有子宮內膜基質干/原始細胞特征的細胞，該類細胞似乎屬于MDSCs家族。然而，Cervelló等[23]開展的實驗顯示，BMDSCs可能只是一種激活子宮內膜細胞分化從而使子宮修復再生的限制性外生因子，而非循環(huán)的干細胞來源。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)行BMDSCs治療的大鼠模型中雌、孕激素受體均有顯著的提高，提示BMDSCs移植可能是通過提高雌、孕激素受體的表達從而對受損的子宮內膜進行功能學修復[24]。此外，BMDSCs具有促進血管系統(tǒng)生成的作用[25]。研究[26]發(fā)現(xiàn)BMDSCs移植的大鼠模型與對照組相比，其子宮內膜組織可表達更高水平的成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors, FGF)、類胰島素生長因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，這些因子都會提高子宮內膜細胞和子宮肌細胞的增殖能力，促進微血管重建，使子宮內膜恢復接受胚胎并支持其發(fā)育[26]。BMDSCs移植促進子宮內膜增殖，提高妊娠率的能力亦已在大鼠模型中得到驗證[27-29]。一系列研究均證明BMDSCs可使傳統(tǒng)宮腔粘連治療無效的受損子宮內膜再生。

2011年，Nagori等[30]為1位重度宮腔粘連患者進行自體干細胞移植治療并使患者成功妊娠。他們從患者的骨髓中分離出子宮內膜血管源干細胞，在對患者行刮宮術后于超聲引導下將這些細胞置于子宮內膜腔，當子宮內膜達到合適的厚度后，該患者接受了體外受精并最終受孕。2015年，研究[31]進行了自體細胞療法治療難治性宮腔粘連和子宮內膜萎縮癥的先導實驗，受試患者接受了自體CD133+BMDSCs移植聯(lián)合激素替代療法，其中11名宮腔粘連患者均有月經(jīng)情況改善，宮腔粘連程度降低同時子宮內膜厚度增加及血管生成，部分患者通過自然或人工方式相繼受孕[31]。

子宮局部缺血/再灌注損傷可促進BMDSC向子宮內膜募集。BMDSCs可表達一種趨化因子受體CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4)，CXCR4與其配體，即基質來源因子(C-X-C motif chemokine 12, CXCL12)在調節(jié)干細胞返回中發(fā)揮了重要作用。大鼠模型試驗[32]證明，CSCL12在宮腔粘連的子宮內膜修復過程中促進了BMDSCs遷移至子宮內膜，同時可使宮腔粘連的大鼠更短時間受孕并且產(chǎn)胎更多。這些結果提示在BMDSCs移植前進行宮腔鏡下粘連松解術，并在移植之后使用CXCL12或其他CXCR4受體激動劑可能提高宮腔粘連的治療效果。

4 脂肪間充質干細胞

脂肪間充質干細胞(adipose mesen derived stem cells, AMDSCs)在細胞表型、分化能力等方面與BMDSCs相似，但其來源更豐富，取材創(chuàng)傷小，體外增殖速率快，易于大規(guī)模量產(chǎn)。

Kilic等[33]從雄鼠的脂肪組織中分離出干細胞并移植入宮腔粘連的雌鼠模型中，觀察到移植后雌性大鼠的子宮內膜纖維化水平降低，且血管內皮生長因子、增殖細胞核抗原、細胞增殖相關核抗原Ki-67等多種細胞增殖標記物表達升高。同時，該試驗還發(fā)現(xiàn)AMDSCs聯(lián)合使用雌激素效果更佳，可有效促進子宮內膜細胞增殖。

AMDSCs作為一種更易獲得的資源有望成為子宮內膜重建領域良好的細胞來源。但有研究發(fā)現(xiàn)，移植體內的AMDSCs存活時間較短，且對損傷發(fā)生部位的靶向性較差。祁旻龍等[34]考慮到人AMDSCs中缺乏炎癥趨化因子受體2(chemokine receptor 2, CCR2)，而已有證據(jù)表明CCR2可促進細胞的遷移和聚集、加快組織修復過程，因此通過慢病毒感染設計構建過表達CCR2的AMDSCs，并移植到創(chuàng)傷模型小鼠的創(chuàng)面4周，發(fā)現(xiàn)損傷部位的修復顯著加快。該試驗提示誘導CCR2過表達或可增強AMDSCs的靶向性。

5 人胚胎干細胞

人胚胎干細胞(humanEmbryonic stem cells, hESCs)來源于胚胎的內胚層，可在體外分化為3個胚層。多項研究顯示hESCs在特定的培養(yǎng)介質中可以分化為各種細胞類型。

2015年，有研究[35]將hESCs與小鼠子宮內膜基質細胞共培養(yǎng)，誘導其分化為子宮內膜樣上皮，其表面可表達雌、孕激素受體、細胞角蛋白、上皮細胞連接分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)、β-微管蛋白等，證實了hESCs可以向子宮內膜樣細胞分化[35]。同年，有研究[36]將hESCs與子宮內膜基質細胞共同培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)出子宮內膜樣細胞，并將hESCs來源的細胞聯(lián)合膠原支架移植入子宮被全層破壞的大鼠模型，12周后，該細胞存活下來，且其中一個子宮重度損傷大鼠模型子宮角的結構和功能得到恢復。

然而，使用胚胎以分離干細胞在倫理學上仍有爭議。此外，臨床試驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)體外誘導的hESCs可能會成為腫瘤細胞的來源。

6 誘導多能干細胞

考慮到使用hESCs的限制性，誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)為再生醫(yī)學領域提供了一項新的工具。經(jīng)過重新編程的iPSCs通常與hESCs有同樣的自我復制和分化為3胚層的能力。iPSCs的優(yōu)點包括可對患者體細胞中特定的轉錄因子進行異位表達而獲得，從而避免了排異的可能性[37]。

研究[38]證明了iPSCs可從小鼠的胚胎成纖維細胞和成人成纖維細胞通過對4種轉錄因子，即Oct-3/4(octamer-binding transcription factor 3/4)，Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2)，c-Myc和Klf4(Kruppel-like factor 4)進行反轉錄病毒轉染而獲得。有實驗[39]發(fā)現(xiàn)人子宮內膜成纖維細胞誘導獲得的iPSCs有分化為中胚層和外胚層組織的能力。Park等[40]發(fā)現(xiàn)iPSCs也可從進行了Oct-4、Sox2、Klf4、Myc轉換的子宮內膜細胞培養(yǎng)并重新編程得到。這些結果都證明了子宮內膜可以作為干細胞或成纖維細胞的來源以誘導iPSCs，該類型的iPSCs或可在將來成為干細胞治療宮腔粘連的最佳選擇。

7 展 望

干細胞現(xiàn)已成為一種恢復性細胞治療的潛在資源而被廣泛探索應用。對于接受傳統(tǒng)激素聯(lián)合手術及后續(xù)治療的宮腔粘連患者，其子宮內膜的恢復情況并不十分理想，因此科學家們轉而探索干細胞修復子宮內膜以作為宮腔粘連的一種新的治療方式，但該項技術尚有許多問題亟待解決，如: 種細胞的選擇，需要選取一種獲取簡便、性質穩(wěn)定并且可以大量復制擴增的干細胞；以及干細胞的最佳定向誘導分化條件和效率；干細胞的移植時間、途徑、劑量、復合作用機制問題；此外，需要尋找某種對患者傷害較小的方法嚴格監(jiān)測移植至人體內的干細胞的安全性和質量，以上這些問題都有待于進一步研究，也是現(xiàn)在干細胞應用的主要探索方向。雖然迄今為止，對于利用干細胞修復子宮內膜的研究大多仍局限于動物模型或小樣本量的臨床試驗，尚無大規(guī)模臨床試驗，但隨著研究的進一步深入，相信干細胞移植治療在未來一定能為眾多宮腔粘連等子宮內膜再生障礙性疾病患者帶來新的希望。