胃癌術(shù)后外周血CK20 mRNA及腹腔沖洗液中IL-6、IL-10、CEA、TNF-α 的變化分析

郭德洋，趙曉許，黃元哲，趙建波

(許昌市人民醫(yī)院胃腸外科，河南 許昌 461000)

胃癌屬于臨床常見的惡性腫瘤，發(fā)病率較高，預(yù)后較差，目前外科手術(shù)一直是治療胃癌的主要手段，近年來隨著腹腔鏡技術(shù)不斷完善，在胃癌的外科治療中扮演著越來越重要的角色，研究發(fā)現(xiàn)即使接受根治性手術(shù)術(shù)后，仍有近50－70%的胃癌患者發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移并導(dǎo)致死亡，尤其是在手術(shù)時已經(jīng)出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者漿膜被侵犯的患者中更為明顯[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)胃癌微轉(zhuǎn)移同疾病復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后關(guān)系密切，而外周血中胃癌微轉(zhuǎn)移檢測是早期發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移的重要方法，常用的特異性標(biāo)記物包括了外周血中細(xì)胞角蛋白20等基因，在臨床預(yù)后的判斷中應(yīng)用廣泛[2]。本研究觀察了胃癌手術(shù)后患者外周血中細(xì)胞角蛋白20以及多種炎癥因子和腫瘤標(biāo)記物濃度變化，旨在為臨床上對胃癌微轉(zhuǎn)移的檢測提供一定的理論依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 取河南省許昌市人民醫(yī)院實(shí)施胃癌根治手術(shù)的117例患者，收治時間為2015年1月－2016年9月，根據(jù)手術(shù)方法分為腹腔鏡組60例、傳統(tǒng)組（傳統(tǒng)開腹手術(shù)）57例。腹腔鏡組，男36例、女24例，年齡43～76歲，平均58．5±12．0 歲。 傳統(tǒng)組，男 32 例、女 25 例，年齡 40～77 歲，平均 56．7±13．5 歲。 兩組患者的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。

1．2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1．2．1 納入標(biāo)準(zhǔn) ⑴胃癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考人民衛(wèi)生出版社《診斷學(xué)》中的標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)前經(jīng)胃鏡檢查及術(shù)后病理學(xué)確診；⑵在我院實(shí)施胃癌根治手術(shù)；⑶胃癌TNM分期Ⅰb～Ⅲc期；⑷均由我院同一組醫(yī)護(hù)人員實(shí)施手術(shù)；⑸本研究獲得患者的知情同意及醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1．2．2 排除標(biāo)準(zhǔn) ⑴術(shù)前具有放化療病史；⑵胃出血、胃穿孔、腸梗阻患者；⑶合并其他部位惡性腫瘤疾病；⑷伴有凝血功能疾病。

1．3 手術(shù)方法 傳統(tǒng)組：采取開腹手術(shù)治療，患者全麻滿意后，在腹正中線劍突下取長度15cm切口，進(jìn)入腹腔，手術(shù)醫(yī)師探查腹腔了解腫瘤位置、大小、胃周浸潤和侵犯切口，了解淋巴結(jié)浸潤情況與腹腔臟器轉(zhuǎn)移情況；采用超聲刀按照無瘤操作原則游離胃，根據(jù)腫瘤位置清掃淋巴結(jié)，采用腸道切割閉合器、吻合器對標(biāo)本進(jìn)行切除并重建消化道，手術(shù)結(jié)束后進(jìn)行止血，采用生理鹽水沖洗腹腔，留置引流管，術(shù)后給予常規(guī)抗炎支持治療。腹腔鏡組：采用腹腔鏡手術(shù)治療，全麻滿意后，經(jīng)臍孔建立氣腹，常規(guī)建立主操作孔和輔助操作孔，腹腔鏡下探查腫瘤位置、大小、胃周浸潤和侵犯情況，觀察淋巴結(jié)浸潤和臟器轉(zhuǎn)移情況，在腹腔鏡輔助下使用超聲刀按照無瘤操作原則游離胃，根據(jù)腫瘤位置進(jìn)行淋巴結(jié)清掃，在腹中線劍突下方取6cm小切口使用腸道切割閉合器完成標(biāo)本切除，使用吻合器、閉合器進(jìn)行消化道重建，手術(shù)結(jié)束后進(jìn)行止血操作，使用生理鹽水沖洗腹腔，留置引流管，術(shù)后給予常規(guī)抗炎支持。

1．4 觀察指標(biāo)及檢測方法 抽取患者晨起空腹靜脈血5ml，采用肝素抗凝試管保存，搖勻放入－80℃液氮速凍保存，采用RT－PCR法測定患者外周血中細(xì)胞角蛋白20濃度變化，首先進(jìn)行RNA提取，取肝素抗凝血，加入淋巴細(xì)胞分離液9ml，37℃孵育15min，每隔5min顛倒混勻，在分離機(jī)1500轉(zhuǎn)離心10min，棄上清加入試劑，分別移出至無菌離心管中，室溫下放置5min，加入氯仿0．2ml，室溫震蕩充分混勻，放置2～3min 12000r/min離心15min。吸取上清液置于另一無菌離心管中，加入異丙醇，室溫下放置10min 12000r/min，離心15min。棄上清，加，75%乙醇1ml以120000r/min離心5min。棄上清，半干時使用DEPC水30μl溶解，即所得需要的RNA。其次進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取2μg細(xì)胞總DNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行cDNA合成，反應(yīng)總體積20μl。第三部進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物采用 primer設(shè)計，CK20 上游引 物 ：5’－CAGACACACGGTGAACTATGG －3’； 下 游 引 物 ：5’ －GATCAGCTTCCACTGTTAGACG －3’； 擴(kuò) 增 長 度370bp。 PCR 反應(yīng)條件：94℃變性 1min，58℃復(fù)性45s，72℃延伸1min，反復(fù)循環(huán)30次。對患者腹腔沖洗液進(jìn)行收集，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定IL－6、IL－10、CEA及TNF－α水平變化（試劑均由西門子公司生產(chǎn)提供， 編號：LKPN14、LK6FD、LDAO15、LPMO215）。

1．5 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計軟件采用SPSS 16．0，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行統(tǒng)計描述，組間比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P值＜0．05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 兩組患者的一般情況比較 腹腔鏡組和傳統(tǒng)組的年齡、性別、病灶部位、TNM分期、清掃淋巴結(jié)數(shù)目、手術(shù)方式、手術(shù)時間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；腹腔鏡組的出血量、住院時間顯著的低于傳統(tǒng)組（P＜0．05）；（表 1）。

表1 兩組患者的一般情況比較

2．2 兩組患者腹腔沖洗液中 IL－6、IL－10、CEA 及TNF－α水平比較 手術(shù)開始時，腹腔鏡組和傳統(tǒng)組的腹腔沖洗液中 IL－6、IL－10、CEA 及 TNF－α 水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；手術(shù)結(jié)束時，腹腔鏡組的腹腔沖洗液中 IL－6、IL－10、CEA 及TNF－α 水平低于傳統(tǒng)組（P＜0．05）；兩組患者手術(shù)結(jié)束時腹腔沖洗液中 IL－6、IL－10、CEA 及 TNF－α水平均較手術(shù)開始時顯著的升高 （P＜0．05）；（表2）。

2．3 兩組患者外周血中CK20 mRNA水平比較 術(shù)前，腹腔鏡組和傳統(tǒng)組的外周血中CK20 mRNA水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；術(shù)后 72h，腹腔鏡組的外周血中CK20 mRNA水平低于傳統(tǒng)組 （P＜0．05）； 兩組患者術(shù)后 72h外周血中 CK20 mRNA 水平較術(shù)前顯著的升高（P＜0．05）；（表 3）。

3 討論

胃癌屬于國內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤之一，每年死于胃癌患者高達(dá)25萬人，死亡率位居惡性腫瘤首位，目前胃癌治療主張采取外科手術(shù)治療為主的綜合方案，5年生存率可達(dá)到30～40%[3]。手術(shù)過程中應(yīng)激反應(yīng)屬于非特異性全身反應(yīng)中的一種，手術(shù)作為直接的外環(huán)境刺激，一方面通過交感－腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)激活，促進(jìn)大量的兒茶酚按物質(zhì)釋放，同時可以激活單核－巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，活化體內(nèi)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，激活了多種細(xì)胞因子與炎癥遞質(zhì)[4，5]；另一方面可以激活下丘腦－垂體－腎上腺系統(tǒng)，造成體內(nèi)激素水平變化，引發(fā)機(jī)體出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，患者免疫、代謝和造血等功能出現(xiàn)改變，而腹腔鏡手術(shù)和開腹手術(shù)作為應(yīng)激來源必然造成機(jī)體創(chuàng)傷[6]。近年來腹腔鏡手術(shù)在臨床胃癌治療中效果顯著，手術(shù)安全性和近期療效較好，但是在手術(shù)對于人體應(yīng)激反應(yīng)、免疫功能影響等方面研究尚不深入，腹腔鏡手術(shù)較開腹手術(shù)微創(chuàng)優(yōu)勢明顯，一方面對組織解剖更為精細(xì)，容易實(shí)現(xiàn)腫瘤不接觸技術(shù)，另一方面通過采用超聲刀電凝鉤等先進(jìn)凝血設(shè)備開展手術(shù)，對于淋巴管和血管斷端凝結(jié)效應(yīng)更為可靠，減少了開腹手術(shù)銳性切割，減少了手術(shù)過程中腫瘤細(xì)胞從血管和淋巴管脫落。但是臨床研究發(fā)現(xiàn)胃癌微轉(zhuǎn)移和胃癌復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及預(yù)后關(guān)系密切，對其早期發(fā)現(xiàn)意義重大，通過外周血胃癌微轉(zhuǎn)移檢測是重要的檢查方法之一，此外檢測腹腔沖洗液中炎癥因子以及腫瘤標(biāo)記物對胃癌患者預(yù)后判斷也具有重要意義[7，8]。

表2 兩組患者腹腔沖洗液中IL-6、IL-10、CEA及TNF-α水平比較（±s）

表2 兩組患者腹腔沖洗液中IL-6、IL-10、CEA及TNF-α水平比較（±s）

觀察指標(biāo)時間手術(shù)開始時手速結(jié)束時組別腹腔鏡組傳統(tǒng)組t值P值腹腔鏡組傳統(tǒng)組t值P值IL－6（pg/ml） IL－10（pg/ml） CEA（ng/ml） TNF－α（pg/ml）3．82±0．93 3．60±0．87 1．32 0．199 33．06±8．35 53．94±15．27 9．238＜0．001 42．8±11．0 44．0±14．1 0．515 0．608 68．9±12．5 87．1±15．8 6．928＜0．001 236．8±59．7 242．5±61．5 0．509 0．612 1463．2±381．5 2263．0±557．8 9．092＜0．001 7．62±2．49 7．41±2．16 0．486 0．628 35．97±9．09 62．84±15．40 11．562＜0．001

表3 兩組患者外周血中CK20 mRNA水平比較（±s，/βactin）

表3 兩組患者外周血中CK20 mRNA水平比較（±s，/βactin）

組別腹腔鏡組傳統(tǒng)組t值P值術(shù)前 術(shù)后72h 60 57 n 0．318±0．067 0．322±0．072 0．311 0．756 0．429±0．107 0．583±0．116 7．469＜0．001

本研究中分析了外周血中細(xì)胞角蛋白20濃度變化以及腹腔沖洗液中 IL－6、IL－10、CEA 及TNF－α水平變化情況。細(xì)胞角蛋白屬于特異性標(biāo)志物，具有20多種異構(gòu)體，主要分布在上皮細(xì)胞中間纖維，腫瘤細(xì)胞多保留起源細(xì)胞CK類型，通過檢測不同類型細(xì)胞角蛋白可以識別腫瘤細(xì)胞起源。有研究顯示外周血中細(xì)胞角蛋白20在正常人中檢測為陰性，但在胃腸道惡性腫瘤中異常表達(dá)明顯，其在組織中分布具有明顯規(guī)律，通過收集患者淋巴結(jié)、血液以及骨髓等標(biāo)本進(jìn)行檢測可以判斷在這些組織中是否存在腫瘤微轉(zhuǎn)移情況[9]。目前細(xì)胞因子是臨床常用的評估手術(shù)創(chuàng)傷造成的應(yīng)激反應(yīng)程度的重要早期臨床指標(biāo)，其中白細(xì)胞介素－6屬于參與應(yīng)激反應(yīng)和體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)重要細(xì)胞因子，該因子主要來自單核巨噬細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞，手術(shù)創(chuàng)傷會造成體內(nèi)白細(xì)胞介素－6顯著升高，且升高程度同手術(shù)創(chuàng)傷程度呈正相關(guān)，白細(xì)胞介素－6升高會激活下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)軸，讓人體內(nèi)腎上腺皮質(zhì)激素水平升高，導(dǎo)致人體炎癥反應(yīng)程度加重，免疫功能降低[10，11]。白細(xì)胞介素10則屬于人體主要的抗炎因子，能夠拮抗促炎細(xì)胞因子，可以抑制白細(xì)胞介素6分泌增多，同時抑制中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞活性，減輕體內(nèi)炎癥反應(yīng)程度，同時該因子還可以阻滯腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移，對胃癌微轉(zhuǎn)移具有抑制作用[12]。CEA則是人體重要的腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物，主要存在多種上皮性腫瘤細(xì)胞中，是胃癌復(fù)發(fā)篩查重要的指標(biāo)，也是判斷胃癌預(yù)后獨(dú)立因素之一[13]。腫瘤壞死因子屬于炎性細(xì)胞因子，參與全身炎癥反應(yīng)，通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞黏附刺激機(jī)體局部炎癥反應(yīng)發(fā)生，同時可以激活誘導(dǎo)性一氧化氮合酶讓體內(nèi)一氧化氮增多，刺激外周血單核細(xì)胞釋放炎癥因子，加重了體內(nèi)炎癥反應(yīng)[14，15]。

本研究顯示，腹腔鏡組和傳統(tǒng)組的年齡、性別、病灶部位、TNM分期、清掃淋巴結(jié)數(shù)目、手術(shù)方式手術(shù)時間比較無明顯差異，而腹腔鏡組的出血量、住院時間顯著的低于傳統(tǒng)組，說明應(yīng)用腹腔鏡手術(shù)在胃癌患者中可以減少出血，縮短住院時間。在對兩種手術(shù)方式后患者腹腔沖洗液中IL-6、IL-10、CEA及TNF-α水平比較，手術(shù)結(jié)束時，腹腔鏡組的腹腔沖洗液中IL-6、IL-10、CEA及TNF-α水平低于傳統(tǒng)組，說明兩種手術(shù)均會造成患者局部炎癥反應(yīng)發(fā)生，但是腹腔鏡組患者炎癥指標(biāo)變化幅度小，在控制機(jī)體局部炎癥反應(yīng)方面具有優(yōu)勢。在對患者外周血中CK20 mRNA水平比較發(fā)現(xiàn)，術(shù)后72h，腹腔鏡組的外周血中CK20 mRNA水平低于傳統(tǒng)組，說明腹腔鏡手術(shù)有助于控制患者腫瘤細(xì)胞微轉(zhuǎn)移。本研究優(yōu)勢在于分析了CK20以及腹腔沖洗液中細(xì)胞因子變化情況，通過對不同細(xì)胞因子變化探討了惡性腫瘤微轉(zhuǎn)移情況，有助于對胃癌患者預(yù)后進(jìn)行判斷，為臨床提供了一定的依據(jù)。但是研究也存在一定的局限性，隨訪時間不足、樣本量少等缺陷均會影響結(jié)果準(zhǔn)確性，同時對于手術(shù)以外的放化療、免疫治療等方式對于研究結(jié)果的影響也未能深入分析，因此還需要進(jìn)一步開展深入研究以期對臨床胃癌患者治療起到真正的指導(dǎo)作用。

綜上所述，胃癌患者術(shù)后腹腔沖洗液中IL-6、IL-10、CEA及TNF-α、外周血CK20 mRNA水平均會升高，提示手術(shù)可能加大腫瘤發(fā)生微轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，尤其是傳統(tǒng)開腹手術(shù)的風(fēng)險更大。