禽源布利丹沙門菌的鑒定及耐藥性分析

朱天倫，陳 革，繆衛媛，高 尚，楊躍飛，王彥紅

(1. 揚州大學獸醫學院，江蘇揚州225009 ； 2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇揚州225009)

沙門菌是革蘭染色陰性，具有廣泛宿主的一種腸道桿菌，可引起多種動物沙門菌病及人類食物中毒和感染性腹瀉。其中布利丹沙門菌是一種可引起人類感染的致病菌，在北京、廣州等多地引起過多次人類食物中毒，2005年在山東還曾有引起兒童化膿性腦膜炎的報道[1-3]。從禽類病料中分離出布利丹沙門菌的報道較少，為進一步做好疾病防治工作，了解布利丹沙門菌對禽類養殖及人類食品安全的影響，本試驗對臨床采集到的布利丹沙門菌進行分離鑒定，對其藥敏反應及生化特點進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 病料來源 本試驗分離得到的3株細菌均來自于2017年7月-10月間揚州大學動物醫院收到的送檢病死雞，分別編號J1～J3。J1是江蘇揚州寶應的5月齡雞，飼養100只，死亡率較高，病雞剖檢發現喉部充血，腸道有較多蛔蟲和大量的絳蟲。J2為江蘇揚州1年齡以上的草雞，飼養10只，死亡2只，送檢1只，病程7 d左右。J3為江蘇邵伯真武的草雞，145日齡，飼養400～500只，就診后用磺胺藥，剖檢發現腸道有很多大小不一的線蟲，肝臟有大小不一的白色壞死灶，膽囊充盈，腸道內容物鏡檢發現球蟲。

1.2 主要試劑 用市售的普通綿羊血和普通營養瓊脂粉按常規方法配制成血瓊脂平板，按常規方法配制的麥康凱瓊脂平板；生化培養管和藥敏試紙,購自杭州微生物試劑有限公司；沙門菌屬診斷血清,購自寧波天潤生物藥業有限公司。

1.3 細菌分離培養 挑選病死雞的肝臟按常規無菌操作接種于血瓊脂平板上，放置于37 ℃條件下培養24 h后，挑選疑似單菌落分別在綿羊血培養基與麥康凱培養基上進行純化培養。觀察純化菌的生長狀況和形態特征。

1.4invA鑒定 利用PCR擴增invA基因能特異性檢測沙門菌[4]。根據文獻方法合成特異性引物[5]，將分離株采用煮沸裂解法制備出細菌基因組DNA模板，并將其進行PCR擴增，PCR體系為25 μL，分別是：2.5 μL 10×Buffer、0.5 μL dNTP、0.2 μL上游和下游引物、0.25 μLTaq聚合酶、19.55 μL 超純水、2 μL模板DNA。取PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.5 生化試驗 用接種針挑取純化后的細菌單個菌落，分別接種于乳糖、木糖、枸櫞酸鹽、衛茅醇、蔗糖、尿素、阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、鳥氨酸、麥芽糖、賴氨酸、甘露醇、靛基質、硝酸鹽還原、V-P試驗、M.R.試驗氨基酸對照生化管內反應，置37 ℃條件培養48 h，按生化反應管說明書進行判斷。

1.6 藥敏試驗 采用Kirby-Bauer藥敏紙片的方法，采用頭孢曲松、氟苯尼考、美洛西林、多粘菌素B、多西環素、新霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、慶大霉素、復方新諾明、鏈霉素、諾氟沙星、左氧氟沙星、環丙沙星、妥布霉素、阿莫西林、頭孢噻肟、舒巴坦這18種藥敏紙片，在無菌條件下，挑取經過純化的菌株，涂布均勻于麥康凱培養基上，取藥敏紙片貼于平板瓊脂面上，于37 ℃條件下培養24 h觀察結果，測量出各抗生素紙片的抑菌圈直徑。藥敏試驗抑菌范圍標準來自杭州微生物試劑有限公司。

1.7 血清型鑒定 取少量沙門菌A-F多價診斷血清于潔凈的玻片上，用接種環挑取綿羊血平板上純培養的待檢菌與之混勻進行玻片凝集試驗，同時設生理鹽水對照，2 min內觀察是否出現凝集現象。在診斷為沙門菌后，再使用O群診斷血清和H診斷血清進行凝集試驗。根據診斷結果查閱Kauffman-White沙門菌抗原式確定被檢菌的菌型。

2 結果

2.1 細菌分離 病料接種于血瓊脂平板培養48 h后出現密布的小菌落,在麥康凱培養基上出現無色、針尖大小菌落。病料J1～J3對應編號為S1～S3。

2.2invA的PCR擴增 經過PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳分析，3個樣品均出現約330 bp目的條帶，分離菌株均為沙門菌。

2.3 生化試驗鑒定 細菌接種于微量生化反應管內，37 ℃培養48 h，鑒定結果顯示善株分離株不能發酵乳糖、蔗糖，能發酵果糖、葡萄糖、阿拉伯糖，不產生硫化氫，不產生吲哚，能還原硝酸鹽，V-P試驗呈陰性，甲基紅試驗呈陽性， 均基本符合沙門菌的生化特性。

2.4 藥敏試驗結果 藥敏試驗顯示，分離株對慶大霉素、頭孢噻肟、舒巴坦、妥布霉素、阿莫西林、左氧氟沙星、卡那霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考有較高的敏感性；對多粘菌素B、鏈霉素、復方新諾明有較高的耐藥性。

2.5 血清型鑒定結果 3株分離菌株與沙門菌A-F多價血清進行玻板凝集試驗，結果均出現凝集反應。后用O群診斷血清、H診斷血清分別與分離菌株進行凝集試驗，結果顯示，分離株與O:9、O:12因子發生凝集，與H：g、H：m、H：q抗原發生凝集，因此，分離株的血清型均為[O9,12:H:g,m,q]，3株分離株皆為布利丹沙門菌。

3 討論

根據分離株的生長特性、生化特點以及invA鑒定，從送檢雞樣品中分離出沙門菌，血清型鑒定結果顯示，3株分離菌均為布利丹沙門菌。從藥物敏感試驗結果來看，3株分離菌對慶大霉素、頭孢噻肟、舒巴坦、左氧氟沙星、卡那霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考有較高的敏感性，且3株分離菌存在略微的差異，這可能與養殖戶使用了不同的藥物有關。

雖然并未見布利丹沙門菌對養殖業造成極大危害的報道，但該菌可引起人類感染，一般癥狀可表現為腹痛，腹瀉，嘔吐，發熱等。查閱相關文獻發現[6-13]，布利丹沙門菌引起人類食物中毒多集中于夏季，由天氣炎熱、衛生條件差、食材不新鮮、冰箱、工具等生熟混放、混用導致交叉污染等原因引起，一般經過3-4 d的治療便可痊愈。檢測出感染布利丹沙門菌的食物多為肉類及蛋類，推測為動物性食品本身攜帶，而天氣炎熱，衛生條件差導致了細菌迅速繁殖及傳播[6-13]。高溫煮沸對細菌有殺滅作用，所以在食物中毒高發季節，應更重視對食品衛生安全的監測，提示人們在食品加工時一定要完全煮熟，并且避免工具的生熟混用。