影響金花茶組織培養芽增殖生長的幾種因素

龍 敏，沈 遐，劉 芳，俞建妹，包 晗

(南寧樹木園，廣西 南寧 530031)

1 引言

金花茶(CamellianitidissimaC. W. Chi)，屬于山茶科山茶屬，是目前為止發現的唯一一種開金黃色的山茶花，是世界珍稀觀賞樹種和種質資源，與銀杉、桫欏、珙桐等珍貴“植物活化石”齊名，被譽為“植物界的大熊貓”，“茶族皇后”。金花茶除了有觀賞價值外，藥用和保健價值也被人們廣泛認可，此外，還含有特殊的色澤遺傳基因，具有較高的科研價值[1]。隨著金花茶價值不斷被開發利用，市場上對金花茶苗木的需求不斷增加，而其傳統的種子和扦插繁殖育苗材料有限、育苗周期長[2]，因此金花茶組織培養技術研究就成了其發展的新風向。國內對金花茶組織培養相關研究已有一些報道。莊承紀和程金水等從金花茶子葉誘導胚狀體再生成完整植株；廖漢刃等以莖段為外植體成功培育出試管無根苗并與油茶苗砧嫁接形成完整植株，繼代增殖率2.8～6.2；顏慕勤等研究了廣西7種金花茶組織培養技術，驗證了適合大多數茶科的基本培養基為改良ER培養基，并成功應用于雜交金花茶幼胚的早期培養；黃昌艷等以防城港金花茶種胚誘導成功培育出組培苗，增殖系數3.79，并進行壯苗培養后直接移栽；李桂娥等建立了金花茶組培快繁體系，增殖系數4.2，生根率達86%?？梢?，金花茶組織培養研究已取得一定進展，但仍有待完善。本試驗旨在研究影響金花茶組織培養芽增殖生長的幾種因素，為金花茶組培苗產業化生產提供技術支撐。

2 材料與試驗方法

2.1 材料

供試材料來源于廣西南寧樹木園金花茶基因庫中優選的生長健壯、花朵繁多,花產量較高的金花茶植株當年生嫩枝，通過莖段消毒滅菌、初代培養獲得的組培繼代芽。

2.2 試驗方法

2.2.1 不同生長調節劑及濃度配比對芽的增殖

在Q (MS+50 mg/L Na2SO4)的基本培養基基礎上，采用雙因素正交試驗設計，添加不同濃度6-BA(2.0 mg/L 、3.0 mg/L、 4.0 mg/L)配以IAA和NAA，后兩者濃度梯度均為0 mg/L，0.5 mg/L，1.0 mg/L。每處理接種10瓶(500 mL三角瓶，以下試驗相同)，每瓶接種6叢叢芽(5～7顆芽/叢，以下試驗同)，重復3次，接種40 d統計芽增殖情況。

2.2.2 不同濃度水解酪蛋白對不定芽的增殖

在Q+6-BA3.0 mg/L+NAA1.0 mg/L培養基基礎上添加水解酪蛋白，濃度梯度為0 mg/L ，100 mg/L,300 mg/L,500 mg/L,700 mg/L,900 mg/L。每處理接種10瓶，每瓶接種6叢叢芽，重復3次，接種40 d觀察記錄芽增殖數量和質量的情況。

2.2.3 芽褐化現象的遏制

在Q+6-BA3.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+CH 300 mg/L培養基基礎上分別添加核黃素15 mg/L、抗壞血酸10 mg/L和活性炭500 mg/L，每處理接種10瓶，每瓶接種6叢叢芽，重復3次，接種40d觀察記錄芽增殖過程中的褐化情況。

2.2.4 溫度條件對不定芽的增殖

在Q+6-BA3.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+CH 300 mg/L+抗壞血酸10 mg/L培養基上接種健壯繼代芽，置于不同培養溫度條件下進行培養，試驗的溫度梯度為15～20℃、21～25℃、26～30℃，每處理接種10瓶，每瓶接種6叢叢芽，重復3次，接種后不斷觀察繼代芽生長情況。

2.3 培養條件

上述所有培養基添加蔗糖30 g/L，瓊脂4.5 g/L，pH值5.8，培養基經高溫高壓( 121 ℃，0.14 MPa) 滅菌15 min。除試驗外，繼代芽在光照強度800～2000 Lx的條件下培養7～10d,再置于4000～6000Lx的光照條件下培養，光照時間12～14 h/d，培養室溫度21～25 ℃。光照主要來源于太陽散射光。

2.4 數據統計與分析

采用Microsoft Office Excel 2007，SPSS統計分析軟件對數據進行處理。公式如下：

芽增殖系數=新增芽數/接種芽總數。

3 結果與分析

3.1 不同生長調節劑及濃度配比對金花茶組培芽增殖的影響

在組織培養中，人工添加不同生長調節劑種類及濃度配比，會共同影響芽增殖的數量和生長情況。正交試驗結果見表1、2。

表1生長調節劑正交試驗設計及結果

序號生長調節劑6-BA(A)IAA(B)NAA(C)芽增殖系數12002.25221.004.37320.50.55.524301.010.52530.50.59.32631.00.59.89740.51.07.588401.06.81941.005.09K112.1419.5811.71K229.7322.4224.73K319.4819.3524.91k14.056.533.90k29.917.478.24k36.496.458.30極差5.861.024.40最佳組合A2B1C3

表2主體間效應的檢驗因變量y

源III 型平方和自由度均方F值P值校正模型61.180a610.19761.3150.016截距418.2021418.2022514.7470.0006-BA(A)14.29527.14842.9800.023IAA(B)2.60521.3027.8310.113NAA(C)7.19223.59621.6250.044誤差0.33320.166總計479.7159校正的總計61.5138

由表1和表2的檢驗結果綜合分析表明，因素A和因素C的P值為0.023和0.044，都小于0.05，說明6-BA和NAA對芽增殖的作用顯著，其中起主導作用的是6-BA，其次是NAA，兩者協同作用，是影響金花茶芽增殖的重要因素。因素B的P值為0.113，大于0.05，顯示IAA在試驗各水平中對金花茶芽增殖作用不顯著，這可能是由于IAA在植物體內運輸緩慢導致。試驗結果顯示最佳的組合為A2 +C3+B1即6-BA3.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+IAA0 mg/L，其平均增殖系數最高為10.52。

由表3多重比較可知，6-BA的水平2和1、3水平差異顯著，1、3水平間差異不顯著，6-BA濃度以3.0 mg/L芽增殖效果最好，芽平均增殖系數達9.910，試驗中最高芽增殖系數達13。NAA水平2、3和水平1差異顯著，2、3水平之間差異不顯著，NAA的水平3與6-BA的水平2濃度配比增殖效果最好。

試驗還發現培養基中單純添加細胞分裂素6-BA2.0 mg/L繼代芽有一定的增殖，但是芽密集粗短，玻璃化嚴重。這說明一定濃度的細胞分裂素可以促進細胞分裂和芽的分化，但欲使芽生長良好，在繼代培養過程中必須要有生長素協同作用。

表3 金花茶芽增殖單因素方差分析結果

3.2 水解酪蛋白對芽增殖的影響

水解酪蛋白含有氨基酸、多肽和蛋白質等豐富的營養物質，其作為一種有機添加物被廣泛應用于組織培養中[3]，對不定芽的分化有良好的促進作用。試驗中發現芽增殖系數較高的培養基培養的芽高生長緩慢，活性不強，為了促進芽健康生長，本試驗在上述Q+6-BA3.0mg/L+NAA1.0 mg/L組合的基礎上添加不同濃度的CH,培養40d芽形態變化、新芽增殖和芽的生長狀況詳見表4。

表4 不同濃度水解酪蛋白對芽增殖影響

表4結果顯示，不同濃度的CH對芽增殖和生長效果不一致，增殖系數大小排序為CH-4>CH-3>CH-2>CH-1>CK>CH-5，其中CH-2、CH-3、CH-4的芽增殖系數較高，分別為12、13、15，當濃度低為CH-1時，芽的長勢差，增殖系數偏低；CH-4芽增殖系數雖然最大，但芽粗短密集，容易出現玻璃化，CH-3芽增殖系數也較高，但繼代芽連續培養3代后，同樣也出現玻璃化芽；當濃度達到CH-5時，芽粗短且玻璃化嚴重最后褐化死亡。因此試驗結果表明較為適宜的水解酪蛋白添加濃度為CH-2(即300 mg/L)，其增殖芽生長健康，扦插生根率高。

3.3 不同添加物對芽褐化現象遏制的效果

金花茶組培芽在繼代培養過程中，芽體褐化現象比較明顯。褐化是完整組織和細胞受到物理傷害，酚類化合物外溢，在酶作用下迅速氧化，形成褐色醌類物質，進一步與組織中的蛋白質發生聚合，導致組織代謝紊亂，甚至死亡的現象[4]。褐化是植物組織培養中常見的問題，相關研究發現，添加適當的抗氧化劑或吸附劑可以達到降低或抑制褐化的作用。

本試驗在上述試驗優選的培養基基礎上分別添加核黃素15 mg/L、抗壞血酸10 mg/L以及活性炭500 mg/L，并在接種后每天觀察記錄芽體褐化的程度和芽的生長情況，接種40 d各添加物對芽褐化遏制的效果見圖1。

圖1 不同添加物對芽褐化的遏制效果

圖1中，輕度褐化表示接種后單顆芽頂芽褐化，褐化部分小于1/3；中度褐化表示單顆芽的1/3～1/2褐化；重度褐化表示單顆芽的1/2以上褐化。

圖1顯示培養基中添加15 mg/L核黃素對抑制芽的褐化效果不明顯，全部出現不同程度的褐化，其中輕度褐化的芽僅占瓶內芽數的5%，而中度、重度褐化共占95%，以中度褐化為主；添加抗壞血酸，無褐化和輕度褐化占97%，表明10 mg/L抗壞血酸對金花茶繼代芽的增殖過程中出現的褐化現象抑制效果較好；添加活性炭可在一定程度上抑制褐化，無褐化占25%，輕度褐化占26%，中度、重度褐化占49%，其對褐化的抑制作用仍低于抗壞血酸，且活性炭雖然能夠吸附芽體釋放的褐化物質，但也會吸附培養基的有效成分。由此可見，添加抗壞血酸10 mg/L遏制芽褐化的效果比較理想。

3.4 溫度對金花茶芽生長的影響

適宜的溫度是保障植物正常生長的重要條件。金花茶性喜溫涼但懼炎熱的環境。本試驗將接種的繼代芽置于不同溫度條件下培養40d芽增殖和生長結果見表5。

表5顯示，T1溫度15～20℃條件下繼代芽增殖系數偏低，芽生長緩慢，原因可能是因長時間培養室溫度偏低導致植株的生理活性降低；T2溫度21～25℃條件下芽的增殖系數最高達12.3，芽生機勃勃，平均株高3.8 cm，是最適合金花茶組培芽的增殖和生長的溫度范圍；當溫度提高到26～30 ℃時，繼代芽接種第3 d即有葉片發黃現象，第7 d后逐漸出現枯葉落葉，甚至整株芽的葉片全部落光至死，大部分的繼代芽無新芽增殖，因此，芽的增殖系數最低，分析其原因主要是培養溫度過高導致植株體內代謝紊亂，生長失衡。

3 結論與討論

隨著6-BA濃度提高，芽增殖系數先上升后下降，試驗中6-BA濃度3.0 mg/L的增殖系數最高，這與黃昌艷(2016)在金花茶種子萌發與快速繁殖技術研究結果相類似，本試驗還研究了6-BA與生長素協同作用于金花茶組培芽的增殖，增殖系數10以上，就增殖系數而言，較優于國內有關的金花茶組織培養研究結果。

表5 不同培養溫度對金花茶組培芽增殖和生長

對于金花茶組培芽褐化的遏制，抗壞血酸的作用優于核黃素和活性炭，因為抗壞血酸是一種普遍存在于植物組織的抗氧化物質，其作為自由基消除劑，可以成為初級抗氧化物直接清除單線態氧、超氧化物和羥自由基[5]，而植株體產生的酚類化合物正是由羥自由基與芳烴核(苯環或稠苯環)直接相連形成的有機化合物，因此添加抗壞血酸能較好的與酚類化合物結合，阻止醌類褐化物質產生，因而起到調節金花茶組培芽體內的氧化還原代謝的作用，同時基本上對培養基的有效成分無影響，因此選擇抗壞血酸作為添加物以抑制芽體的褐化效果良好。

金花茶喜歡溫涼環境，本試驗最適溫度范圍21～25 ℃，在實際生產中要同時考慮到成本問題，尤其是高溫季節室外溫度一般在28～35 ℃，培養室溫度長期控制在21～25 ℃耗電大成本高，因此是否可以將溫度基本控制在25 ℃±2 ℃，在此溫度區間內金花茶組培芽能否正常生長，有待進一步研究。