“分解纖維素的微生物的分離”實驗的細節(jié)補充

陳 婷 王怡坤 俞如旺

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350117)

“分解纖維素的微生物的分離”是人教版高中教材選修1中的一個實驗，包括土壤取樣、選擇性培養(yǎng)纖維素分解菌、菌懸液的濃度梯度稀釋、涂布平板法分離細菌、纖維素分解菌的觀察與鑒定等步驟。本文對該實驗的操作步驟進行一些細節(jié)補充，能夠有效地提高該實驗的成功率，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，提高學(xué)生對微生物的分離、培養(yǎng)與鑒別能力。

1 土壤取樣

收集富有纖維素分解菌的土壤樣品，應(yīng)選擇纖維素豐富的土質(zhì)。如花盆土、多年積累的枯枝敗葉、腐殖土等[1]。具體操作： 在校園中選擇落葉豐富的區(qū)域，撥開樹葉，用小鏟取葉下腐殖質(zhì)豐富的土壤。在報紙上將土壤碾碎，并用鑷子取出土壤中較大的沙石、樹葉、樹根、蟲卵等物質(zhì)，將剩余土壤放入無菌袋中備用。需注意的是： 選取土壤樣本時切勿選用過于疏松，含大量樹葉、樹根的土壤。因為，此類土壤在搖床培養(yǎng)時會出現(xiàn)大量碎屑，影響菌懸液濃度梯度稀釋過程中的菌液采集。

如若校園中無法找到合適的、富有纖維素的土壤，也可以將濾紙埋在約10cm深的土壤處，一段時間后即可獲得具有分解纖維素能力的大量微生物。人教版高中教材選修1中提及： 將濾紙埋在土壤中，30d左右能夠從濾紙中獲取大量纖維素分解菌。但筆者利用校園環(huán)境，將濾紙埋在夏季溫暖、濕潤的校園花園中，僅需7d左右便可從濾紙上獲取大量纖維素分解菌。

2 選擇性培養(yǎng)纖維素分解菌

利用纖維素分解菌的選擇性培養(yǎng)基，可使土壤混合菌落中的纖維素分解菌成為優(yōu)勢種群，從而在液體培養(yǎng)基中大量富集。具體操作： 按照纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方配置30mL的培養(yǎng)基倒入錐形瓶中，封口后在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。在無菌環(huán)境下，稱取6～10g土壤于選擇性培養(yǎng)基中，置于30℃、250rpm的搖床培養(yǎng)1d左右至培養(yǎng)基變混濁，取上層懸液備用。

但筆者經(jīng)反復(fù)實驗得出，忽略選擇性培養(yǎng)纖維素分解菌這一步驟，直接將土壤溶于生理鹽水中，制備菌原液能夠獲得更好的實驗效果。其原因有二： ①選擇性培養(yǎng)纖維素分解菌的過程易受培養(yǎng)時間、溫度等因素影響；②過度培養(yǎng)土壤懸液中的各種細菌，會導(dǎo)致選擇性培養(yǎng)基中菌量過大，反而造成培養(yǎng)基中含氧量降低、營養(yǎng)物質(zhì)減少等結(jié)果，最終影響土壤中纖維素分解菌的菌種豐富度。

因此，若忽略選擇性培養(yǎng)纖維素分解菌后，將土壤溶解于生理鹽水中，可制備土壤樣品在生理鹽水中的菌懸液。具體操作： 將6g土壤樣品加入30mL生理鹽水中，置于30℃、 250rpm的搖床上，振蕩培養(yǎng)0.5～1h左右，取上層懸液備用。該操作能夠使土壤中的各種微生物充分溶于生理鹽水，提取出較為原始的土壤菌群。

3 菌懸液的濃度梯度稀釋

選擇性培養(yǎng)基制備的菌懸液中菌濃度極高，若以其作為母液，直接接種于鑒別性培養(yǎng)基上，會導(dǎo)致鑒別性培養(yǎng)基中菌的分布過于密集，從而出現(xiàn)菌落重疊的現(xiàn)象，不利于后續(xù)的觀察。因此，在實際操作中應(yīng)以選擇性培養(yǎng)基中的菌液或生理鹽水中的菌液作為菌原液，進行密度梯度稀釋。該操作可以有效降低培養(yǎng)基中的菌數(shù)，便于培養(yǎng)出單菌落，從而進行后續(xù)的實驗。具體操作： 取一支試管，加入9mL生理鹽水和1mL菌懸液并搖勻，制成濃度為10-1菌懸液；在濃度為10-1菌懸液中取1mL懸液加入另一支裝有9mL生理鹽水的試管中并搖勻，制成濃度為10-2菌懸液。按照上述操作，可依次制備出10-1～10-6濃度梯度的菌懸液。富集培養(yǎng)后的菌懸液一般需要將濃度稀釋至10-2～10-4，才能容易將菌落分散開，出現(xiàn)清晰的單一菌落；而未富集培養(yǎng)的菌懸液一般是將菌懸液濃度稀釋至10-2～10-3最為適宜。

值得注意的是，筆者在實驗操作中兩次以無菌生理鹽水取代教材中提及的無菌水，進行土壤樣品溶解、制備菌原液及菌懸液的濃度梯度稀釋等步驟。原因在于： 生理鹽水不僅是人體細胞的等滲液，也是細菌細胞的等滲液，能夠維持細菌的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，使其保持生命活性。并且生理鹽水能夠為細菌細胞的生命活動提供所需的無機鹽，有利于細菌生長。

4 涂布平板法分離菌株

采用涂布平板法將稀釋后的菌懸液接種至鑒別培養(yǎng)基中，能夠使懸液中的菌均勻地分散在培養(yǎng)基上，便于對纖維素分解菌的觀察、鑒別、計數(shù)與挑選。具體操作： 將制備好的菌懸液搖勻后，選擇濃度適宜的菌懸液進行涂布平板。在無菌條件下，用移液槍取0.1mL菌懸液至瓊脂固體培養(yǎng)基中，并用涂布棒將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基上，室溫放置2～3min，使菌液完全被培養(yǎng)基吸收。用封口膜封口，將培養(yǎng)基倒置在30℃左右的恒溫箱中培養(yǎng)1～2d即可。培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)，可以防止在培養(yǎng)菌的過程中產(chǎn)生的水滴落到培養(yǎng)基上，沖散菌落。

若條件允許，可在接菌前，預(yù)先倒好培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，將其倒扣并置于32℃左右的恒溫箱中烘干2～3h。該做法能有效減少培養(yǎng)基中的水分，使菌液更快被培養(yǎng)基吸收，避免培養(yǎng)基染菌或出現(xiàn)水痕。

5 纖維素分解菌的觀察與鑒定

快速鑒別纖維素分解菌的方法有很多，其中剛果紅染色法是目前比較常用的一種鑒別的方法[2]。剛果紅能夠與纖維素形成紅色復(fù)合物，因此可用其鑒定纖維素或纖維素分解菌。將剛果紅加入固體培養(yǎng)基中，剛果紅與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物，因此培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色；含有纖維素分解菌的菌落，由于纖維素分解菌分解其周圍纖維素，因此其周圍的纖維素含量較低或無纖維素的存在，則菌落周圍無紅色復(fù)合物形成，因而出現(xiàn)以菌落為中心的透明圈。其中，常用的剛果紅染色法有兩種，具體操作如下：

方法一： 將適量的剛果紅加入尚未凝固的培養(yǎng)基中，充分溶解，可配置出纖維素分解菌的鑒別性培養(yǎng)基。再進行菌落接種的培養(yǎng)，從而觀察單一菌落周圍培養(yǎng)基的情況。為使纖維素分解菌周圍的透明圈更易觀察，須將培養(yǎng)基置于白色背景，如白色硬紙板前；并適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)觀察角度，可明顯觀察到部分菌落周圍存在透明圈。調(diào)節(jié)剛果紅的濃度，使其在培養(yǎng)基中的濃度適當(dāng)，能更容易觀察到透明圈。經(jīng)筆者反復(fù)實驗、比較得出，當(dāng)剛果紅在培養(yǎng)基中的濃度約為0.3g/L時，培養(yǎng)基既能保持一定透明度，又能和透明圈出現(xiàn)明顯色差。

方法二： 先在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌群，待菌落長出，加入適量1mol/L的剛果紅溶液染色，等待15min后倒去培養(yǎng)皿內(nèi)的剛果紅與浮起的菌落。再加入適量1mol/L的NaCl溶液漂洗一次，洗去浮色。

比較兩種方法，以方法一進行纖維素分解菌的觀察與鑒定能更容易觀察到菌落的實際大小、形態(tài)。以方法二進行纖維素分解菌的觀察與鑒定雖然可以在培養(yǎng)基上觀察到較為明顯的透明圈，但形態(tài)結(jié)構(gòu)較為光滑的細菌染色、漂洗過程中容易浮起并被帶走，因此不利于菌落的形態(tài)的觀察，難以保留菌種。

(基金項目： 教育部人文社會科學(xué)研究規(guī)劃基金項目“核心素養(yǎng)導(dǎo)向的科學(xué)課程高中學(xué)業(yè)水平考試實施策略與命題研究”，No.17YJA880088;*通信作者)