CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在豬基因編輯中的研究進(jìn)展

李 尚，石 崗，馮韶華，張正敏，周一彤，蘆春蓮，曹洪戰(zhàn)

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071001）

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)由規(guī)律成簇間隔短回文序列（CRISPR）和CRISPR 相關(guān)蛋白9（Cas9）組成，廣泛存在于細(xì)菌和古菌中，是機(jī)體長期進(jìn)化形成的由RNA 指導(dǎo)的降解外源遺傳物質(zhì)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。由于該系統(tǒng)可以識(shí)別靶向序列完成DNA 雙鏈切割，因此自2013 年起，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)被改造為基因編輯工具，其具有設(shè)計(jì)簡單、特異性強(qiáng)、效率高等優(yōu)點(diǎn)，為基因組定向改造調(diào)控和應(yīng)用帶來了突破性革命，并在一些領(lǐng)域中得到廣泛研究和應(yīng)用。而因?yàn)镃RISPR/Cas9 存在脫靶效應(yīng)和外源基因插入困難等問題，在一定程度上限制了CRISPR/Cas9 的應(yīng)用。

1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)

1.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的組成及功能 根據(jù)PSSM 矩陣庫（NCBI 提供）綜合分析基因組數(shù)據(jù)，在原來Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型基礎(chǔ)上引入了新型Ⅳ和Ⅴ[1]。近年來根據(jù)CRISPR系統(tǒng)Cas 編碼的復(fù)合物將上述Ⅰ～Ⅴ分為“1 類”和“2類”。1 類系統(tǒng)具有多重亞基crRNA 效應(yīng)子復(fù)合物，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型CRISPR 系統(tǒng)，2 類系統(tǒng)的效應(yīng)子復(fù)合物都是Cas9，包括Ⅱ和Ⅴ型CRISPR 系統(tǒng)[2]。Ⅱ型（CRISPR/Cas9）系統(tǒng)是CRISPR/Cas 系統(tǒng)中最簡單，也是目前研究最為徹底、應(yīng)用最為廣泛的系統(tǒng)。

完整的CRISPR 位點(diǎn)依次包括Cas 基因、前導(dǎo)區(qū)以及由短回文重復(fù)區(qū)（repeat）和間隔區(qū)（spacer）構(gòu)成的CRISPR 序列。上游Cas 基因有豐富的多態(tài)性，編碼蛋白有核酸酶的功能；前導(dǎo)區(qū)可看作CRISPR 序列的啟動(dòng)子，激活轉(zhuǎn)錄；下游CRISPR 序列中的回文序列一般21～48 bp，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；間隔區(qū)即細(xì)菌捕獲外源DNA，相當(dāng)于細(xì)菌建立“黑名單”，產(chǎn)生獲得性免疫[3-4]。

1.2 基因編輯技術(shù) 基因組特定位點(diǎn)的DNA 雙鏈斷裂（DSB）可以激活細(xì)胞內(nèi)部的修復(fù)機(jī)制，進(jìn)而大幅度提高同源重組的效率。……