泛素化特異性蛋白酶18在結直腸癌中的表達及其臨床意義

易禮智，程征宇，王 琴，徐 輝

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上最常見惡性腫瘤之一[1]，也是我國第四常見的惡性腫瘤，其引起的死亡率呈逐年增長的趨勢[2]。轉移和復發是CRC患者死亡的主要原因。盡管隨著科學技術的進步，近年來結直腸癌的臨床診斷和治療方法及藥物研究有了很大的進步，但CRC的長期生存率并未明顯提升[3]。因此，探討結直腸癌發生的分子機制仍具有重要的意義。泛素特異性蛋白酶18 (Ubiquitin-specific peptidase 18，USPl8)是干擾素激活基因15(interferon(IFN)-stimulated gene 15，ISG15)的一個特異性蛋白酶，同時也是與ISG15結合的一個至關重要的調節蛋白[4]。最近有研究[5-7]顯示，USP18的表達在一些腫瘤如膀胱癌、乙肝病毒相關的肝細胞癌等里面異常的異常升高可能與腫瘤的發生有關。本文研究USP18在結直腸癌中的表達及意義，期望能為臨床結直腸癌的治療提供新的靶點及治療策略。

1材料與方法

1.1材料 收集某人民醫院手術切除后經病理診斷為結直腸癌的石蠟組織標本114例，其中男性72例，女性42例；年齡26～76歲，平均年齡53.8歲。另外收集40對新鮮的結直腸癌組織和癌旁正常腸黏膜組織置于液氮中保存備用。逆轉錄試劑盒、RNA裂解液(Trizol)及熒光定量PCR試劑購自Takara公司，BCA法蛋白定量試劑盒及PVDF膜購自Pierce公司，ECL發光液購自凱基生物公司，兔抗人USP18抗體、β-actin鼠抗人單克隆抗體、及鼠、兔二抗均購自proteintech公司，SP二步法試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1蛋白免疫印跡法 提取組織蛋白并測濃度后，取等量的總蛋白變性后經10%SDS．PAGE凝膠電泳，濕轉法轉印至PVDF膜上，室溫下用5%的封閉血清BSA封閉1 小時，兔抗人USP18抗體(1:300)、β-actin鼠抗人單克隆抗體(1:1000)稀釋，4℃孵育過夜，次日用含0.1% 吐溫的TBS(PBST)緩沖液漂洗5 分鐘，重復三次，加入抗兔或抗鼠(1:10000)二抗，室溫孵育1小時，PBS-T漂洗5 分鐘，重復三次后常規顯色發光。

1.2.2實時定量PCR 采用Trizol裂解組織后，提取RNA并測濃度，按照逆轉錄試劑盒說明書反轉錄成cDNA后，進行實時定量PCR檢測。引物序列：USP18上游 5'-CCTGAGGCAAATCTGTCAGTC- 3' 和 5'-CGAACACCTGAATCAAGGAG TTA-3'；GAPDH 上游 5'-GTCCACCAC CCTG TTGCTGTA-3'、下游：5'-CTTCAACA GC GACACCCACTC-3'。GADPH基因作為參照基因。PCR反應體系20ul，反應條件：95℃預變性2 分鐘，95℃變性 10秒，58℃退火40秒，72℃延伸 30秒，共40個循環。導出PCR目的基因和參照基因的Ct值，計算2-ΔΔCt值進行相對定量。2-ΔΔCt值越大，說明該基因的表達量越高，實驗重復3次。

1.2.3免疫組化 石蠟組織連續切片后，經脫蠟脫水后，檸檬酸高溫高壓5 分鐘進行抗原修復，依次孵育一抗和二抗，DAB顯色。USP18以細胞漿和細胞核內出現淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞，根據顯微鏡下腫瘤細胞的染色范圍分為4個等級：0分：陽性細胞數<5%；1分：陽性細胞數5%～25%；2分：陽性細胞數26%～50%；3分：陽性細胞數>50%；依據對每張切片陽性細胞的染色強度進行評定，0分：無著色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。兩者計分的乘積作為染色結果的評判標準：陰性(-)：0分；弱陽性(+)：1～4分；陽性(++)：5～8分；強陽性(+++)：9～12分。

1.3統計學方法 分析采用SPSS20．0進行數據分析，USP18的表達水平和臨床病理相關資料的相關性采用Wilcoxon Signed Ranks檢驗分析和Spearman相關分析。

2結 果

2.1在新鮮結直腸癌組織中的表達 在40例新鮮的結直腸癌組織中，mRNA水平上，有26例CRC組織中USP18蛋白的表達顯著高于正常黏膜組織，14例低于正常黏膜組織(圖1A)。統計分析結果顯示：CRC組織中USP18的表達水平顯著高于正常結直腸黏膜組織中的表達量(P=0.006)(圖1B)。蛋白水平上，在8例配對組織中，有7例CRC組織中USP18蛋白的表達顯著高于正常黏膜組織，1例低于正常黏膜組織(圖1C)。

圖1：USP18在40對新鮮結直腸癌組織mRNA水平(圖A: N:正常組織，T：癌組織，圖B：*P=0.006)和8對新鮮結直腸癌組織中蛋白檢測 (圖C: β-Actin為內參)

2.2在結直腸癌石蠟組織中的表達情況 USP18的表達定位于胞漿與胞核，在結直腸癌組織中，USP18 的表達率為95.7%%，癌旁正常黏膜組織中的表達率為25.3%，結直腸癌組織中USP18的表達要明顯高于癌旁正常粘膜組織(圖2)，兩者差異有統計學意義(Z=-5.876，P<0.001)。

2.3結直腸癌組織中USP18蛋白表達及臨床病理參數的關系 分析結果顯示：癌組織中USP18表達的高低與腫瘤分化程度、是否有遠處轉移及淋巴結轉移有關，均P<0.05，而與腫瘤患者的性別、年齡、浸潤深度無關，P>0.05。見表1。

圖2USP18 在正常組織和癌組織的表達(A圖：正常組織40X10倍，B圖：癌組織，40X10倍)。

參數例數高表達低表達Pλ2年齡0.3430.899<6030219>=60846618性別87270.1631.944男725814女422913分化程度0.00112.487高41347中503713低23167是否遠處轉移0.0404.197否795623是35314淋巴結轉移0.0039.002是58526否563521浸潤深度0.3051.469累及全層28199未累及全層866818

3討 論

本文主要探討了USP18在結直腸癌新鮮組織及石蠟組織中的表達情況。USPl8位于染色體22q11.2，是一種泛素特異性蛋白酶，也是類泛素干擾素刺激基因15(ISGl5)[8, 9]。USP18在調節細胞信號通路中起著很重要的作用，包括p53相關細胞的存活，NF-κB的活性等，USPl8的增加，會使信號處理途徑、細胞增殖異常，胸腺T細胞凋亡。因此，USP18與腫瘤的發生與發展也是密切相關的。目前關于USP18在腫瘤中的作用報道較少,僅見于少數幾種腫瘤如乙肝病毒相關的膀胱癌[6]、肝細胞癌[7]、黑色素瘤[10]、乳腺癌[11]、腎癌[12]和前列腺癌[13]等。而在結直腸癌中尚未見報道。

本研究首先檢測了USP18在40例配對新鮮結直腸癌組織中的mRNA水平及8例配對新鮮結直腸癌組織中的蛋白水平。結果發現，USP18在結直腸癌組織中的mRNA及蛋白水平均明顯高于正常組織。而后我們在114例配對結直腸癌石蠟組織中檢測了USP18的表達情況。結果顯示結直腸癌組織中的表達要明顯高于癌旁正常粘膜組織。結合臨床病理資料分析發現，USP18的表達與分化程度、遠處轉移及淋巴結轉移密切相關，而與腫瘤患者的性別、年齡、浸潤深度無關。這表明結直腸癌組織中USP18的升高可能與結直腸癌的增殖和轉移相關。研究報道[14]顯示USP18在白血病的潛伏期和發展期有重要的調節作用[14]；乳腺癌細胞株MCF-7中USP18的缺失可以誘導由化療和干擾素α(IFN-α)引起的凋亡的增加[15]；沉默USP18，同樣也能引起膠質母細胞瘤凋亡的增加[16]；敲低USP18后，可以直接導致急性早幼粒細胞白血病(APL)細胞增殖降低和凋亡增加，可以作為治療APL的一個臨床抗腫瘤治療靶點[17]。這些報道都說明USP18與腫瘤的增殖及發展有密切的關系。在機制方面，目前有研究報道[18,19]稱USP18影響腫瘤的發展主要是通過調控干擾素信號通路，因為IFNs可以抑制蛋白質ISGylation從而在抗腫瘤應答中起重要作用。另有研究報道[11]顯示USPl8基因的缺失能夠抑制腫瘤活性，可以通過上調Cxcr3配體來調節腫瘤微環境，尤其是CxcllO；USPl8還可以調控CD4+T細胞的抗腫瘤作用[20]；活化的UBP43酶可以直接影響細胞周期蛋白D1的穩定性：敲除UBP43可以抑制細胞周期蛋白D1的表達，促進細胞凋亡[13]。在后續的研究中，我們將著重研究USP18促進結直腸癌侵襲和增殖的分子機制及其在臨床治療中的應用價值。

綜上所述，本實驗結果表明，USP18在結直腸癌組織中呈高表達，且與結直腸癌的遠處轉移和淋巴結轉移密切相關，提示USP18可能參與結直腸癌的發生、進展和轉移。本研究為結直腸癌的治療提供一個新的潛在靶點。