認識非洲豬瘟及其窗口期檢測的重要意義

鐘建舟

（寧鄉市東湖塘鎮農業綜合管理服務中心，湖南 寧鄉 410612）

非 洲 豬 瘟(African Swine Fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)引起的一種豬的急性、烈性、高度接觸性傳染病,嚴重危害著全球養豬業的健康發展。我國將非洲豬瘟列為一類動物疫病，是烈性外來疫病，其強毒力毒株對生豬致病率高，致死率100%。自2018年8月3日遼寧省沈陽市沈北新區發生第1 起疫情以來，截至2019年4 月23 日，農業農村部已經公布的疫情共129起，疫情累計捕殺生豬達到102 萬頭，我國除了港澳臺的31 個省區市已經全部發現非洲豬瘟疫情[1]。面對如此嚴峻的疫情形勢，早發現早診斷ASFV 感染生豬，可以為廣大養豬場防控非洲豬瘟疫情贏得先機。

1 非洲豬瘟病毒特點和臨床癥狀

1.1 病毒特性及疫苗研發瓶頸

ASFV 是非洲豬瘟病毒屬中一種大顆粒、有囊膜的病毒，直徑175 ～215 nm，核衣殼蛋白呈20 面體對稱，直徑180 nm，基因組由單分子線狀雙股DNA 組成，長度為170 ～190 kb。DNA 分子具有共價的閉合末端、反轉重復區和發夾結構，編碼200 多種蛋白質[2]。感染ASFV 后會造成家豬和一些野豬種暴發出血性疾病。在遺傳學上，該病毒是一種復雜的雙股DNA 病毒，包含用于致病、免疫逃逸和細胞過程調制的一系列基因。根據p72 基因的部分序列，科技人員已發現此病毒有23 個基因型。

ASFV 體積龐大，基因組結構復雜，抗原種類繁多，已經失去了成為高效疫苗的基礎條件。在非洲豬瘟的預防和治療方面，縱使世界各國的科學家孜孜不倦地努力并花費巨資開展研究，仍然收效甚微，國際上勉強推出的試驗性疫苗也最終被證實有害無益。

1.2 病毒傳播和臨床癥狀

ASFV 可以通過與感染動物——家豬或者野豬——直接接觸傳播，或者通過來自感染動物的污染物或生肉的間接接觸傳播，抑或是通過節肢動物媒介，尤其是鈍緣蜱屬的軟蜱間接傳播。ASFV 在蛋白質環境中高度穩定，且對高溫的抵抗力相當強，需要在60 ℃下經過20 min 才能失活。ASFV 在家豬之間的傳播主要通過上呼吸道感染發生，因為已有研究證明家豬可以通過它的所有分泌物和排泄物排出有感染性的病毒，ASFV 在感染家豬的口鼻液中濃度尤其高。被病毒感染的豬死亡后，ASFV 在死豬的血液和組織中能夠持續存活非常長的時間，因此，給豬飼喂生的泔水會導致ASF 的傳播。病死豬剖檢后的污染擴散、感染豬群打架后的流血和感染后的便血可能會成為ASFV感染的新路徑。空氣傳播途徑已在動物高密度飼養的實驗室環境中被證實。

在我國ASF 屬于“糞口傳播”的疾病，放任大量的病豬進入屠宰廠污染環境、污染泔水、污染飼料，一旦源頭治理失守，ASFV 便隨著帶毒仔豬、污染豬肉和污染飼料流通向各地，勢必使非洲豬瘟疫情將成燎原之勢。

ASF 臨床病變可以通過多種途徑表現，從無征兆的死亡(最急性型，死亡率約100%)到無癥狀感染；然而，ASFV 的大多數分離株會使家豬出現急性出血熱，并引發近100%的死亡率。研究發現所有年齡段的豬對ASFV 感染均表現出相同的易感性，這與經典豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)不同——幼齡豬更易感CSFV。ASFV 急性感染是由強毒株造成的，其典型的特征性癥狀表現為高熱、食欲減退、昏睡、虛弱、臥地不起、腹瀉和/或便秘、腹痛、出血癥、呼吸困難、流涕和流淚以及妊娠母畜的流產[3]。感染ASFV 的豬只死亡時間通常出現在臨床癥狀出現后的7～10 d。根據ASFV毒株的毒力，急性感染通常是無該病區域開始暴發疫情時的主要形式；然而，該病一旦發生，通常會發展成為長期持續存在的亞急性臨床型。中等毒力的ASFV 毒株會引發亞急性感染(通常幼齡豬表現出高死亡率，年齡較大的豬死亡率較低)，臨床癥狀通常包括流產、發熱、短暫性出血，在3 ～4 周內死亡或恢復。慢性感染的豬死亡率非常低，病豬以間歇熱或低熱、食欲減退和精神沉郁為特征；在某些情況下，會引發致死性感染。感染維持數月的病豬，如病毒儲庫、亞臨床癥狀或慢性感染的豬，可能對疾病在流行地區持續存在起一定作用。

1.3 窗口期檢測的重要意義

窗 口 期（Window Period）是指自感染開始至病毒抗原或抗體檢出之間的間隔期。病毒進入機體后通過特殊免疫反應產生抗體，所以檢測病毒抗原的窗口期短于病毒抗體的窗口期。在窗口期內雖然檢測不到血液中的ASFV，但豬只體內已存在該病毒，通過消化道感染的ASFV 主要集中在口腔等黏膜組織內，處于局部感染（local infection）階段，屬于局限性的隱性感染（silent infection）過程。窗口期的感染豬同樣具有傳染性，但傳染性不強。ASF 的窗口期平均為28 d，抓住窗口期的有利時機是目前凈化和控制ASF 的唯一必要手段[4]。

2 窗口期檢測非洲豬瘟的技術要點

2.1 檢測方法的選擇

由于病原窗口期短于抗體窗口期，所以我們選擇的是直接檢測ASFV。ASFV 檢測的方法有聚合酶鏈式反應（PCR）法、熒光定量PCR 法、環介導等溫擴增法和免疫層析膠體金快速檢測法，其中較成熟的是PCR 和熒光定量PCR 法。傳統PCR 法是用瓊脂糖凝膠電泳或者分光光度計測定核酸濃度，其結果不準確而且易污染，實時熒光定量PCR 可以解決這些問題，它的準確性好、靈敏度高且無污染，對一些傳染性疾病可進行定量分析、病原微生物和病毒含量檢測，此項技術都是首選[5]。2019年6月11日，中國動物疫病預防控制中心發布了通過專家評審的ASF 現場快速檢測試劑名單的34 個產品中，有28 個采用熒光定量PCR 法。

2.2 檢測樣本的選擇

實踐中我們常采集口腔拭子和鼻腔拭子作為窗口期的檢測樣本，這2 種拭子的采集便于操作，只需要用棉簽在生豬口腔或鼻腔中來回旋轉，沾取口鼻分泌物后放入相應保存液中即可。但是有報道稱新鮮分泌的唾液具有更大的檢測優勢，其病毒含量遠遠高于口腔拭子和鼻腔拭子，新鮮分泌的唾液中非洲豬瘟病毒CT 值比口鼻拭子中的非洲豬瘟病毒CT 值平均低5 左右[4]。這就意味著新鮮分泌的唾液病毒含量要比口鼻拭子高約32 倍。

2.3 檢測樣本的處理

處于窗口期的生豬具備較強的免疫能力，采集的拭子和新鮮唾液中有活性較高的酶，尤其是唾液中酶，當病毒含量較低時很快就會被酶降解，從而導致假陰性結果的出現。抑制酶活性的保存液是至關重要的，同時低溫保存也能有效地抑制酶的活性。由于處于窗口期的樣本中ASFV 含量較低，有報道稱對生豬采樣之前進行禁食12 h 處理可以獲得優質的樣本。研究證實，試管中的病毒在靜置或者離心狀態下，底部的ASFV 含量遠遠高于試管上清液中的病毒含量，所以建議在采集樣本時從試管底部取樣進行檢測[4]。

2.4 檢測試劑盒的選擇

試劑盒最重要的是準確性、敏感性、時效性和可重復性。因為窗口期樣品病毒含量低，對檢測試劑盒質量要求更高，用戶在選擇時要嚴格篩選。國產的熒光定量PCR 試劑盒中分為兩類：磁珠法提取核酸后進行PCR 檢測和免提取PCR 檢測。免提取PCR 檢測由于沒有純化過程，雜質對擴增反應影響較大，在對窗口期樣品檢測時效果不佳。采用免疫層析膠體金快速檢測的快速檢測卡，雖然操作簡單快速，但是由于特異性不強，可信度較低，也不建議采用。

3 展望

非洲豬瘟進入我國后，國家公布的檢測方法適用于已經發病豬群的臨床檢測，科學的非洲豬瘟窗口期檢測對生豬生產和ASF 防控更具實踐意義，種公豬、母豬和調運的仔豬應該成為窗口期檢測的重點。窗口期的長短與檢測技術的靈敏度有關，靈敏度越高，檢測出ASFV的時間越早，有助于非洲豬瘟疫情的早發現、早診斷、早控制。隨著對ASFV 認識的深入，相信在政府、科研人員和養豬從業者們的共同努力下，定能實現對非洲豬瘟的有效控制。