Reelin蛋白在阿爾茨海默病中的研究進展

周昱君，張 泳，黃龍艦，李萍萍，彭 英

(1. 中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所，北京 100050；2. 中國生物技術發展中心, 北京 100039)

阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease，AD)屬于神經退行性疾病，其主要臨床特征為進行性記憶減退和認知功能障礙，影響患者生存生活能力，并導致其精神和行為異常。腦部主要病理學特征為淀粉樣斑的堆積、神經元纖維纏結、神經細胞凋亡和突觸數量減少等，在疾病發展過程中通常不會出現明顯的臨床癥狀。醫院確診的AD病人中，約95%為散發性AD，多為晚發型AD(late-onset Alzheimer’s disease，LOAD)，疾病發展情況受遺傳因素與環境因素等多方面影響，其中載脂蛋白E4 (apolipoprotein E4，ApoE4)是高風險因素。而常染色體顯性遺傳型AD (autosomal dominant inherited Alzheimer’s disease，DIAD)多發病較早，通常與早老素1基因(PS1)、早老素2基因(PS2)以及淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)有關[1]。

AD的病因尚不明確，相關學說眾多。β-淀粉樣蛋白(amyloid beta-peptides，Aβ)學說認為，AD患者腦部聚集的Aβ神經毒性強，可引起腦部炎癥、細胞凋亡、線粒體功能障礙等一系列效應。以Aβ為靶點的藥物主要分為減少Aβ生成、減少Aβ聚合和加速Aβ清除三方面，涉及到β分泌酶抑制劑、γ分泌酶抑制劑、γ分泌酶調節劑、α分泌酶激動劑以及Aβ抗體和Aβ疫苗等[2]。盡管很多圍繞Aβ學說展開的臨床試驗相繼以失敗告終，但Aβ學說在發病機制的研究中仍占有重要地位。Tau蛋白異常過度磷酸化也是一個重要的學說，其異常磷酸化可影響微管的裝配以及穩定性，以Tau蛋白為靶點的藥物主要涉及激酶抑制劑，Tau蛋白聚合抑制劑以及微管穩定劑等[2]。以信號通路功能異常為核心的學說認為，AD患者神經系統多種信號通路功能異常，導致神經系統功能紊亂。也有研究表明，高脂血癥可加重Aβ對老年AD大鼠神經元的損傷以及Tau蛋白異常過度磷酸化[3]。Reelin屬于分泌型糖蛋白，通過與其受體的相互作用，使細胞質銜接蛋白(Disabled-1, Dab1)磷酸化，進而開啟下游信號通路，早期主要與皮層形成、神經細胞遷移過程相關，后期起到調節突觸功能的作用。近年研究表明，Reelin信號通路可能與AD的發病有密切關系，本文將對Reelin蛋白的結構功能及其所屬通路在AD發病機制中的作用進行綜述。

1 Reelin的結構和功能

Reelin是一種大型的分泌型細胞外基質糖蛋白，由3 641個氨基酸殘基組成，人的RELN基因位于7號染色體。SDS-PAGE凝膠電泳顯示，Reelin有410 ku、330 ku、180 ku以及數個低分子量條帶。Reelin含有信號肽序列，其后是N端序列、鉸鏈區以及八段氨基酸重復序列，以高度堿性的C端序列結束。Reelin在胞外擴散過程中可被切割，位點分別在重復序列2和3(位點N-端)之間，以及在重復序列6和7(位點C-端)之間，完全切割的Reelin可以產生3個片段，N端片段(N端到第2個重復序列)、中央片段(第3～6段重復序列)，以及C端片段(第7段重復序列到C端)。中央區域包含載脂蛋白E受體2 (apolipoprotein E receptor 2，ApoER2)和極低密度脂蛋白受體(very low density lipoprotein receptor，VLDLR)的結合位點，N端區域主要和Reelin同源二聚體的形成有關，影響Dab1磷酸化水平[4]。N端區域還和α3β1整合素等一些受體結合相關。另外，C端區域也會影響Reelin磷酸化Dab1的能力。

胚胎時期，Reelin主要由海馬和皮質分子層中的Cajal-Retzius(C-R)細胞合成并分泌。大腦發育階段，Reelin主要通過控制細胞間相互作用，調節神經細胞遷移和定位。在成人大腦中，Reelin分泌水平下降，但依然發揮重要作用，此時的Reelin主要由γ-氨基丁酸能中間神經元分泌，通過提高對長時程增強(long time potentiation，LTP)的誘導效應，來調節突觸可塑性。Reelin還可調節樹突的生長及成熟、神經遞質釋放等[5]。Reelin缺陷小鼠(Reelin-deficient mice，reeler)樹突分支以及樹突棘減少，雜合reeler小鼠(heterozygousreelermice，HRM)缺失1個RELN等位基因，Reelin表達下調50%，同樣出現樹突分支以及樹突棘輕微減少的情況。但HRM中神經元定位不受影響，表明由Reelin缺陷導致的樹突異常與神經元定位異常無關[6]。Reelin對大腦發育至關重要，但ApoER2的另一種配體ApoE缺陷的患者卻具有正常的認知功能，這可能與ApoE在小鼠和人類中都在相對較晚時期開始表達有關。另外有研究表明，reeler小鼠大腦中脂肪酸(fatty acid，FA)組分發生變化，為發現Reelin新功能提供了基礎[7]。

2 Reelin的受體及下游信號通路

Reelin受體包括ApoER2、VLDLR、α3β1整合素等。敲除ApoER2和VLDLR或者Dab1缺失后出現的reeler表型，表明這些分子對于Reelin正常發揮功能的必要性。遷移過程中，ApoER2可能與起始信號相關，VLDLR則和中止信號相關[8]。

ApoER2的選擇性剪接對Reelin實現其功能有重要作用。Reelin與ApoER2結合后，ApoER2可被一系列蛋白酶切割，釋放可溶性胞外結構域(soluble extracellular domain，ECD)。α分泌酶切割產生的C端片段(C-terminal fragments，CTFs)可被γ分泌酶切割，釋放胞內結構域(intracellular domain，ICD)，Reelin可誘導這種切割，ApoER2切割片段可負反饋調節Reelin信號。ApoER2-ECD可以作為ApoER2配體的顯性負性受體，ApoER2-ICD可以易位至細胞核并改變基因的轉錄，降低Reelin mRNA水平。ApoER2的選擇性剪接可以影響這一系列的切割[6]。

ApoE4是晚發型AD的主要遺傳風險因素。ApoE4與ApoER2結合后，誘導受體降解，并伴隨胞內區室中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的螯合[9]。因此，Reelin可競爭性抑制ApoE對NMDAR和ApoER2的占據，維持突觸可塑性。ApoER2前mRNA經過選擇性剪接可產生兩種形式，含有倒數第2節外顯子的ApoER2亞型在突觸相關信號通路中為有效亞型，而AD病人與轉基因AD小鼠中，有效ApoER2亞型比例均降低，利用反義寡核苷酸改變其選擇性剪接，增加功能性ApoER2/Reelin復合物的形成，可改善突觸功能[10]。

Reelin與受體結合，并啟動下游轉導信號系統。Dab1聚集并激活酪氨酸激酶Src和Fyn，導致Dab1磷酸化。Dab1磷酸化可激活下游激酶，包括PI3K及Akt，最終導致糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)在其抑制性Ser-9位點磷酸化，從而抑制GSK-3β活化。Reelin信號系統有助于突觸形成，通過NMDA受體控制Ca2+進入，從而調節LTP、突觸傳遞和突觸可塑性，與記憶、認知功能密切相關。磷酸化的Dab1可以引起無腦回綜合癥致病基因產物(lissencephaly protein 1，LIS1)聚集，影響微管動力學等。Reelin還可使絲切蛋白(Cofilin，CFL)磷酸化，穩定細胞骨架。

3 Reelin信號轉導通路與AD的相關性

Reelin信號通路在神經系統發育和維持正常功能中有重要作用，許多神經精神障礙，包括阿爾茨海默病、自閉癥、精神分裂癥、雙相情感障礙、抑郁癥等，均有異常的Reelin表達。有研究報道，在reeler大鼠和敲除ApoER2/VLDLR的大鼠腦內，存在高度磷酸化Tau蛋白。AD小鼠模型中，發現淀粉樣蛋白與Reelin表達水平及ApoER2免疫活性具有關聯性[11]。Reelin信號通路在AD中可起到抑制Aβ的產生、促進Aβ的清除、抑制Tau蛋白的高度磷酸化等作用。改變的Reelin表達被認為可以損害神經元連接性和突觸可塑性，最終導致認知缺陷。研究發現，APP/PS1雙轉基因AD小鼠于6月齡出現淀粉樣斑塊，AD小鼠中Reelin在淀粉樣斑周圍聚積形成斑塊，而非正常的二聚體形式，并且聚積的斑塊隨病情的加重而逐漸增加，進而影響Reelin功能的發揮，Reelin的聚集與老年斑的形成可能密切相關，而野生型小鼠極少形成Reelin斑塊[12]。

3.1 Reelin與Aβ的相互影響老年斑(senile plaque，SP)是AD發病的一個重要病理特征，主要為葡萄糖多聚物以及Aβ、Tau、APP、α-突觸核蛋白等在內的多肽類和蛋白質。Aβ由39～43個氨基酸組成，是AD病人腦中發現的淀粉樣斑塊的主要成分，APP被β和γ分泌酶切割可產生Aβ，Aβ異常聚集時形成β淀粉樣斑塊。

Aβ可對Reelin及其所在傳導通路造成損傷。Aβ42存在時，Reelin不能形成同源二聚體的活性形式，AD患者大腦中的Reelin提取物中含有很多高分子團塊，激活ApoER2的能力下降[13]，年齡相仿的對照組中則具有活性的同源二聚體。Aβ影響Reelin活性，并改變其表達的具體機制仍需研究。另外，Reelin的表達變化情況在AD患者中有較大的差異，有報道稱，這種差異與ApoE4基因相關[14]，處于Braak stage晚期且不攜帶ApoE4基因的AD患者，Reelin mRNA水平明顯增加，ApoER2-CTF的水平明顯降低，而攜帶ApoE4基因患者中并未發現這一改變。推測Aβ通過抑制ApoER2，增加Reelin表達，為機體的一種自調節機制。在Aβ存在時，Reelin以一種高水平卻無效的形式存在，即病理狀態下，Reelin信號通路和自我調節機制的失效，而ApoE4攜帶者可能有著不同的Reelin-CTFs平衡。

內嗅皮質是AD最先發生病變的地方。有研究證實，在內嗅皮質2層中，細胞內Aβ選擇性在Reelin免疫反應性細胞內表達，與Reelin明顯共同定位于細胞內，提示Reelin和Aβ的結構相關性。Reelin可與可溶性Aβ42相互作用，從而延緩Aβ纖維形成和募集[15]。Reelin蛋白表達減少的AD小鼠，則表現出增多的淀粉樣斑塊。

與Reelin相反，Aβ寡聚體在突觸后具有拮抗作用，Aβ結合受體后，激活鈣調神經磷酸酶(calcineurin，PP2B)，PP2B調節紋狀體富集的蛋白酪氨酸磷酸酶(striatal-enriched protein tyrosine phosphatase，STEP)的表達水平和活性。STEP的某些靶標同樣是Reelin-ApoER2信號通路中被磷酸化的NMDAR酪氨酸殘基。因此，Aβ介導的STEP激活可導致NMDAR過度內化，Aβ還可通過信號級聯反應激活GSK-3β[16]。

有研究發現，在沒有產生淀粉樣蛋白病理學的情況下，缺乏Reelin和ApoE受體信號傳導通路的成年小鼠表現出較好的耐受性，這可能是由于穩態調節和其他神經調節機制的補償。Reelin通過復雜的信號級聯反應來保護突觸免受Aβ的損害作用，以維持激酶和磷酸酶活性的平衡。已經發現，在成人階段丟失Reelin并沒有引起明顯的認知障礙，這表明健康的中樞神經系統能夠平衡補償Reelin的損失。然而，在Reelin缺陷型小鼠中，Aβ的過度表達使其在Morris水迷宮學習任務中表現出嚴重的學習、記憶損害[17]。

3.2 Reelin對Tau蛋白的影響微管系統是微管蛋白及微管相關蛋白組成的神經細胞骨架成分，Tau蛋白是含量最高的微管相關蛋白。正常Tau蛋白含2～3個磷酸基，與微管蛋白結合，促進其聚合形成微管，維持微管穩定性。而AD患者腦內，每分子Tau蛋白磷酸基可達到5～9個，異常過度磷酸化使其無法發揮正常功能。

在Reelin的轉導通路中，Reelin與受體結合，使Dab1磷酸化，通過一系列級聯反應抑制GSK-3β活性, 而GSK-3β通常使Tau蛋白磷酸化，故Reelin在一定程度上抑制Tau蛋白磷酸化，Reelin表達的減少會導致Tau蛋白磷酸化增加、神經纖維纏結增加[18]。Reelin雜合敲除和ApoE4敲入小鼠均顯示Tau磷酸化水平升高。

細胞周期素依賴蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)可使Tau磷酸化，且不依賴于Reelin信號通路，CDK5也參與鼠腦發育過程中皮層神經元的定位過程，表明Reelin信號通路和CDK5級聯反應之間重疊性。

3.3 Reelin信號通路對突觸的影響AD患者的海馬和皮層突觸功能紊亂，導致早期的記憶、認知損傷。Reelin信號通路對于突觸數量以及功能有重要作用，影響突觸可塑性。LTP是突觸可塑性的一種形式，可被高頻刺激所誘導，使突觸有效性增加。Reelin處理海馬切片時，LTP增加[19]，VLDLR和ApoER2敲除小鼠沒有出現這一現象。研究發現，VLDLR敲除小鼠中高頻刺激誘導的LTP減少，ApoER2受損的小鼠中遲發性LTP明顯延遲。Reelin可參與空間和恐懼方面的記憶形成，通過向小鼠腦室內注射Reelin可以改善學習和記憶[20]。相比于野生型，HRM和reeler小鼠海馬神經元樹突棘減少，并且其減少程度與Reelin蛋白丟失的量有比例關系，而外源性Reelin可以改善這一現象[21]。

Reelin通路可對突觸組分起到調節作用。突觸從發育到成熟的過程中，海馬突觸中NMDA受體的主要組分會發生從NR2B亞單位到NR2A亞單位的改變，使用外源性Reelin處理培養的海馬神經元可加速這一過程，敲減Reelin可抑制這個過程[22]。

大量研究表明，Reelin信號通路可通過NMDA受體調節Ca2+內流，增加LTP，影響突觸傳遞、突觸可塑性以及突觸的形成[23]。Reelin還可增加活性調節型細胞骨架蛋白(activity-regulated cytoskeletal，Arc)mRNA的翻譯，鞏固LTP。NMDA受體在AD早期已出現變化，Aβ的異常聚集影響突觸功能，將海馬神經元與Aβ寡聚體共培育，會導致AMPA、NMDA型谷氨酸受體功能以及LTP受損[24]。應用Reelin可一定程度上逆轉這一現象，Reelin可拮抗Aβ對突觸功能的影響。

4 靶向Reelin的臨床研究

目前，關于Reelin的研究多處于臨床前階段，進入臨床階段的實驗較少。RELN (rs7341475G) 是一個與女性精神分裂癥風險相關的單核酸多態位點，圍繞此位點展開的臨床試驗表明，此位點對實驗中檢測的精神分裂癥相關指標未發現明顯影響[25]。

5 小結

Reelin在發育階段以及完成神經遷移后的成熟腦內，均發揮著舉足輕重的作用。目前已經發現Reelin與多種神經精神疾病相關，其中，Reelin蛋白及所在通路與AD的發病密切相關，在AD疾病進展過程中，Reelin信號通路受到不同程度的損傷。此外，Reelin具有神經保護作用，可抵抗Aβ造成的神經毒性，抑制Tau蛋白過度磷酸化，調節突觸可塑性與LTP。因此，提示Reelin可能成為AD預防和治療的潛在靶點。但Reelin蛋白在AD發病機制中的作用，以及干預Reelin蛋白后AD病理改變的轉歸，仍需要進一步深入研究。