胃炎顆粒中3種活性成分的定性鑒別及芍藥苷含量測(cè)定*

胡 婧，胡 斌，鄧 莉，馬 攀

（陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400038）

胃炎顆粒系我院中醫(yī)科的經(jīng)驗(yàn)方，在古方芍藥甘草湯、黃芪建中湯的基礎(chǔ)上篩選優(yōu)化而來(lái)［1-2］，是由蒲公英、黃芪、白芍、白芷、陳皮、建曲、甘草、佛手等8味中藥材組方的復(fù)方制劑，具有健脾益氣、舒肝和胃、止嘔降逆、清熱消炎的功效。主藥白芍的主要成分為芍藥苷，也是本品的有效指標(biāo)成分之一［3］。為了有效地控制胃炎顆粒的質(zhì)量，本研究中對(duì)胃炎顆粒進(jìn)行了定性、定量研究，運(yùn)用薄層色譜（TLC）法對(duì)3種主藥成分進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定指標(biāo)性成分芍藥苷的含量，旨在為其質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供參考，保障用藥安全。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；AS2060B型超聲清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為 110736-201337，含量為94.9% ），黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)為 110781-200512），白芷對(duì)照藥材（批號(hào)為120945-201309），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；胃炎顆粒（3批，自制，規(guī)格為每包10 g）；甲醇（色譜純，美國(guó)Tedia公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

黃芪：取樣品適量，研細(xì)，稱取10 g置具塞錐形瓶中，加甲醇 50 mL，在溫水（40 ～50 ℃）中超聲（60 kHz）處理30 min，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，殘?jiān)訙厮?0～50℃）20 mL溶解，用水飽和的正丁醇萃取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗2次，每次30 mL，棄去氨試液，水洗2次，每次30 mL，棄去水液，將正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液［4］。另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液［5］。按處方比例取缺黃芪的各藥材，加水煎煮，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，分別取上述溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置分層的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上，日光下顯相同顏色斑點(diǎn)［6］，紫外光燈（365 nm）下顯相同顏色熒光斑點(diǎn)［7］302，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1 A。

白芍：取樣品適量，研細(xì)，稱取10 g置具塞燒瓶中，加無(wú)水乙醇 50 mL，振搖，密塞，超聲（60 kHz）處理 10 min，靜置分層，濾過(guò)，收集濾液，蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 mL溶解，即得供試品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每 1 mL含 1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液［7］105。按處方比例取缺白芍的各藥材，加水煎煮，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇 - 甲酸（20 ∶4 ∶0.05）為展開(kāi)劑［8］，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1 B。

白芷：取樣品適量，研細(xì)，稱取粉末5 g置燒杯中，加水30 mL溶解，超聲30 min，離心5 min，取上清液，溶液轉(zhuǎn)至分液漏斗中，用石油醚（60～90℃）30 mL萃取，靜置10 min，棄去石油醚層，剩余水層再用30 mL乙酸乙酯萃取，靜置10 min，取乙酸乙酯層水浴蒸干至1 mL。另取白芷對(duì)照藥材1 g，同法制得對(duì)照藥材溶液。按處方比例取缺白芷的各藥材，加水煎煮，同法制成陰性樣品溶液。照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板，以二氯甲烷-甲醇（20∶1）為展開(kāi)劑，在20℃下展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1 C。

圖1 薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定［9］

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent-TCC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（7 ∶13 ∶80）［10］；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流速：1.0 mL ／min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃。理論板數(shù)以芍藥苷峰計(jì)大于3 000，且分離度大于1.5。

2.2.2 溶液制備

取芍藥苷對(duì)照品10.29 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，密塞，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.195 3 g／L的芍藥苷對(duì)照品溶液，再精密移取3 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，密塞，搖勻，即得對(duì)照品溶液。取胃炎顆粒適量，研細(xì)，稱取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（60 kHz）處理 30 min，冷卻，擦干外部，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量［11］，搖勻，濾過(guò)，取濾液離心（13 000 r／min，5 min），取上清液，即得。按處方比例取缺白芍的各藥材，加水煎煮，依法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下3種溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。在此色譜條件下，芍藥苷能較好地分離，且峰形良好，保留時(shí)間適中，陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取芍藥苷對(duì)照品 26.62 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為1 010.49 μg ／mL 的芍藥苷對(duì)照品溶液，分別取 0.2，0.4，0.6，0.8，1，1.2 mL 稀釋至 10 mL，制成質(zhì)量濃度為11.72，23.44，35.15，46.87，58.59，70.31 μg ／mL 的溶液，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定，記錄色譜圖，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X，C）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y，A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=13.083X-1.268，r=0.999 9（n=6）。結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣質(zhì)量濃度在20～120 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為17111302），精密稱定，依法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.26%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為17111302），精密稱定，依法制備供試品溶液，分別于 0，2，4，6，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果的RSD為0.57%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為17111302）6份，精密稱定，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果樣品中芍藥苷的平均含量為 1.066 9 mg／g，RSD為0.36%（n=6），表明方法重復(fù)性好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào) 17111302，含量為1.066 7 mg ／g）0.5 g，精密稱定，共 6 份，分別加入芍藥苷對(duì)照品溶液［取芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為110736-201337，含量為 94.9% ）13.82 mg］，精密稱定，依法制備，用甲醇稀釋至50 mL，搖勻，精密吸取上述溶液各2 mL，分別加入上述6份樣品中，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。由于中藥的成分復(fù)雜，雜質(zhì)峰較多，且樣品顏色較深，加樣回收范圍從98%～102%擴(kuò)大至 95% ～105% ，RSD小于 2.0% （n=6），準(zhǔn)確度符合要求。

表1 芍藥苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品（批號(hào)分別為 17070101，171009，17111302）各3份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果，3個(gè)批次9個(gè)樣品中每10 g芍藥苷的含量平均值為14.62 mg。考慮到中藥材原料含量的波動(dòng)，以平均值下浮 20% 作為本品含量的下限［9］，即 14.62 mg ／10 g ×80%=11.69 mg ／10 g，故暫訂本品每袋（10 g）含芍藥苷（C23H28O11）總量不得少于 11 mg。

3 討論

胃炎顆粒成分復(fù)雜［12-13］，白芍為主藥，芍藥苷為白芍中含量較高且較穩(wěn)定的成分［14-15］，故將其作為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量控制，采用HPLC法測(cè)定其含量。在前期的研究中，采用50%的乙醇對(duì)胃炎顆粒進(jìn)行提取，流動(dòng)相采用的是乙腈 - 水（19 ∶81）［16］。本研究預(yù)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在此條件下的色譜圖出現(xiàn)了明顯的雜質(zhì)峰干擾，且目標(biāo)峰芍藥苷的峰面積較小，重復(fù)性差。根據(jù)芍藥苷的理化性質(zhì)，特別是溶解性，采用甲醇和乙醇作為提取溶劑進(jìn)行比較，結(jié)果甲醇的提取率明顯高于乙醇。樣品處理時(shí)，采用不同比例含水量甲醇（20%，50%，80%，100%）進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)100%甲醇的提取效率最高，且雜質(zhì)也最少。在流動(dòng)相的選擇上，在原有研究［17］及2015年版《中國(guó)藥典（一部）》白芍藥材的含量測(cè)定方法［7］105的基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，鑒于芍藥苷在酸性環(huán)境下較為穩(wěn)定，將原流動(dòng)相中的水改為0.1%磷酸溶液，將乙腈改為乙腈-甲醇（7∶13）的混合溶劑，結(jié)果芍藥苷峰形對(duì)稱，基線平穩(wěn)，有很好的分離效果，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果符合2015年版《中國(guó)藥典》的相關(guān)規(guī)定，且減少了乙腈等有機(jī)溶劑的用量，減少對(duì)人的危害和對(duì)環(huán)境的污染，可用于胃炎顆粒中芍藥苷的含量測(cè)定。

根據(jù)3批樣品含量測(cè)定結(jié)果，考慮到本品含量隨原料產(chǎn)地及部位的不同含量有一定波動(dòng)，并考慮大生產(chǎn)實(shí)際，將本品的限度下浮20%，則每袋含芍藥苷為11.69 mg。2015年版《中國(guó)藥典（一部）》白芍藥材項(xiàng)下規(guī)定飲片中芍藥苷含量不得少于1.6%，而每袋本制劑理論含2.667 g白芍。按此限度及正文擬訂的藥材限度計(jì)算，本 品 轉(zhuǎn) 移 率 為 27.4% ［11.69 mg ／袋 ÷ （16 mg／g×2.667 g／袋）×100%=27.4% ］。故本品含量限度設(shè)定是合理可行的。故暫訂本品每袋（10 g）含芍藥苷（C23H28O11）總量不得少于 11 mg。

胃炎顆粒藥味多，陰性干擾大，本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)提取溶劑和展開(kāi)劑的優(yōu)化篩選，對(duì)方中黃芪、白芍、白芷進(jìn)行了薄層色譜鑒別。白芷薄層色譜鑒別中，先采用藥典的方法及常規(guī)制劑，選取的提取方式和展開(kāi)溶劑，陰性有干擾，分離度較差。考慮到白芷主要化學(xué)成分為香豆素和揮發(fā)油，揮發(fā)油類通常采用水蒸氣蒸餾法進(jìn)行提取，香豆素類則主要采取溶劑提取法［10］，因此，考察的成分基本為香豆素類。乙醚雖可溶解多數(shù)香豆素，但能溶出其他脂溶性成分也較多，即按藥典方法進(jìn)行提取后的斑點(diǎn)干擾較多；而石油醚雖對(duì)大多數(shù)含氧香豆素的溶解性并不好，但可除去其他脂溶性成分，利于減少陰性干擾［18］；選擇石油醚（60 ～ 90 ℃ ）先進(jìn)行萃取，再用乙酸乙酯提取剩余水層，取乙酸乙酯層。在采用藥典規(guī)定展開(kāi)劑石油醚（60～90℃）-乙醚進(jìn)行展開(kāi)時(shí)，由于乙醚易揮發(fā)，特征斑點(diǎn)重復(fù)性較差，選擇極性略低于乙醚的二氯甲烷作為基礎(chǔ)展開(kāi)劑［19］，分別采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇等溶劑進(jìn)行配伍，發(fā)現(xiàn)以二氯甲烷-甲醇為展開(kāi)劑，分離效果較理想；先后采用了二氯甲烷-甲醇（10 ∶1，15 ∶1，20 ∶1）等比例調(diào)節(jié)。根據(jù)薄層色譜法所規(guī)定的方法學(xué)要求，最終確定展開(kāi)劑為二氯甲烷-甲醇（20 ∶1）。

綜上所述，胃炎顆粒雖在臨床應(yīng)用多年，但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定已久，考察項(xiàng)目較少，標(biāo)準(zhǔn)不夠完整，更無(wú)有效或指標(biāo)成分的含量控制，本研究中建立了較為完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可滿足日常生產(chǎn)中的質(zhì)量控制，從而保證制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性和有效性。