微衛星標記方法在大型貓科動物保護群遺傳學研究中的應用與挑戰

王 萌 朱思雨 薛茂盛 劉 霖 任迎豐 李立新 許 青 姜廣順*

(1.東北林業大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040；2.中國野生動物保護協會，北京，100029；3.國有濟源市愚公林場，濟源，454650)

貓科(Felidae)動物通常位于食物鏈的頂端，隸屬于脊索動物門(Chordata)哺乳綱(Mammalia)食肉目(Carnivora)貓型亞目(Feliformia)。目前貓科動物分類尚存爭議，《中國動物志》中將貓科動物分為28種，我國有6屬13種[1]。貓科動物分布廣泛，除澳洲和南極洲以外，世界大部分地區都有分布[2]。通常貓科動物分為大型和小型兩類，代表了貓科動物早期的兩個分支[3]。大型貓科具有不完全骨化的舌骨，舌骨中部具有彈性軟骨；小型貓科動物具有完全固化的舌骨，所以它們能發出嗚嗚的貓叫聲但不能發出大型貓科動物那樣的怒吼聲，熟知種類為家貓(Feliscatus)[1]。大型貓科動物通常指非洲獅(Pantheraleo)、虎(Pantheratigris)、豹(Pantherapardus)、美洲豹(Pantheraonca)和雪豹(Unciauncia)。同時，美洲獅(Pumaconcolor)和獵豹(Acinonyxjubatus)體型也較大，也被視為大型貓科動物[4]。作為頂級捕食者，大型貓科動物的存在基于整個自然界：通過改變草食動物對植物的影響，頂級捕食者可以對植物產生強烈的間接影響，而植被依賴于復雜的土壤結構以及構成生態系統的所有相互關聯的生物[4-5]。頂級捕食者的存在可以調節該地區的生態系統，增加其穩定性[6]。

保護遺傳學研究是野生動物保護工作中的重要組成部分。由于人類社會的盲目開采，資源匱乏嚴重威脅著野生動物的生存，許多野生動物僅殘存于破碎的生境中。由于生境破碎化，種群隔離、基因交流中斷、近親繁殖等問題日益嚴重。由于以上原因保護生物學應運而生[7]。保護遺傳學主要包括種群遺傳學，分子生態學，分子生物學，進化生物學等學科[8]。隨著分子遺傳學技術的不斷發展，野生動物保護遺傳學的方法日益增加。目前應用較廣的方法主要有生物芯片標記技術[9-11]、隨機擴增多態性(RAPD)標記[12]、擴增片段長度多態(AFLP)標記[13]、微衛星標記方法[14-16]等。取得樣品時，多采用非損傷性取樣方法[17-18]。野生動物保護遺傳學的研究內容，目前主要集中于遺傳多樣性[19-20]、種群結構[21]、個體識別[22-23]等方面。微衛星標記作為保護遺傳學中應用極其廣泛的方法，具有多態性高，穩定性高等諸多優點，并且由于發生變異較頻繁，尤其適用于較短時間內發生的遺傳分化以及遺傳多樣性分析，在越來越多的研究中都有使用。

對于大型貓科動物的研究目前主要分野生種群和圈養種群的研究。野生大型貓科動物通常為獨居動物，極少群居，并且具有易躲避人類的習性，野生種群的研究通常具有極度的偶然性。對于野生動物的研究通常集中于生態研究、保護遺傳學、種群監測等方面。隨著保護遺傳學的發展，越來越多的遺傳學方法可以應用于野生大型貓科動物的監測保護中。

1 微衛星方法的研究進展

衛星DNA由長串聯重復序列組成，根據重復單位的大小，可分為衛星DNA、小衛星DNA、微衛星DNA 3種[24]。微衛星標記，具有高穩定性、高多態性、引物通用性、位點特異性、檢測方便和呈共顯性遺傳等特點，是廣泛應用于動物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、雌核發育、基因定位及克隆、親權鑒定等的理想分子標記[25]。

1.1 微衛星標記的開發

傳統方法中，微衛星位點已從目標物種的部分基因組文庫中分離出來。微衛星從目標物種基因文庫分離出來后，根據DNA片段的長度、待發現的微衛星重復單元以及片段末端的類型選擇限制酶，通過探針雜交將目的克隆片段從數千個菌落中分離出來[26]。這種方法雖然操作簡單，但是對于微衛星頻率低的物種，該方法效率極低[27]。另一些人提出利用RAPD引物進行PCR擴增未知微衛星位點后利用微衛星探針進行Southern雜交[28-29]。目前，常用于大型貓科動物種群遺傳學的位點多為應用此種方法開發的[30-31]。FIASCO法是另一種開發微衛星標記的方法，相較于之前的方法，FIASCO方法利用AFLP方法標記，效率大為提高[27]。Zhang等曾利用此種方法開發11個應用于華南虎(Pantheratigrisamoyensis)的微衛星位點引物，在57個個體中進行擴增，除一個位點無多態性，其余位點含有4—9個等位基因[32]。

目前，高通量測序方法已經廣泛應用，許多微衛星標記的開發，也使用到了高通量測序的方法。利用高通量測序方法進行微衛星標記開發，具有高效、便捷、準確的特點[33]。萬冬梅等利用高通量測序開發沼澤山雀(Poecilepalustris)微衛星位點，最終成功搜索出2 471個微衛星位點[34]。

1.2 微衛星標記研究概況

微衛星標記在眾多領域都有許多應用，在對于野生動物的種群數量、遺傳多樣性、遺傳結構的研究中越來越多地依賴微衛星標記技術。除此之外，在育種、醫療、法醫等領域微衛星標記技術也有廣泛的應用。在對于大熊貓的研究中，目前以論文形式公開發表的大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)微衛星標記已有109個，利用這些微衛星標記，大熊貓的種群數量、遺傳多樣性、種群結構等諸多方面進行了深入的研究[35]。對于棲息于芬蘭的棕熊(Ursusarctos)的研究中，通過基因流研究并與俄羅斯、瑞典和挪威種群的遺傳組成進行對比，發現俄羅斯的棕熊大量遷入東部種群，加速了東部種群的恢復[36]。

育種方面，微衛星標記常用于監測種群結構以及遺傳潛力[37]。醫學方面，微衛星不穩定性(MSI)與癌癥易感基因以及預后的關系為近年來的研究熱點[38-39]。法醫方面，通過對現場被害人或罪犯遺留的血痕、精斑、毛發、骨骼等人體材料做出個人識別或同一性鑒定[40]。

2 利用微衛星方法對于大型貓科動物進行遺傳學研究

野生大型貓科動物難以捕捉，通常將非損傷性取樣方法與微衛星標記方法相結合，以便在不傷害野生動物的情況下獲得其遺傳樣本，并監測其種群遺傳多樣性，種群結構等相關遺傳參數。

2.1 非損傷性取樣方法

采用非損傷性取樣方法，可以從脫落的毛發及羽毛中，糞便、尿液中，甚至蛋殼中提取到DNA[41]。糞便樣品相較于其他非損傷性樣品具有較多優點。糞便樣品具有可獲得性高，可識別度高，不干擾動物正常活動，安全，DNA含量較大，可獲得多元遺傳信息等優點[42]。采集后可以對其進行物種分布、食性、性別、個體以及數量、種群密度進行鑒別及估算[43]。

目前糞便中DNA提取相較于肌肉DNA、肝臟DNA來說質量較差，成分復雜，不僅含有目標物種腸道脫落細胞，還含有大量的腸道微生物、食物殘渣、酶、脂類、蛋白質、多糖等代謝物質。未提取時容易被糞便中微生物降解，對于儲存有較高要求[44-46]。并且在基因分型時容易無PCR產物或獲得錯誤基因分型[47-50]。但是研究野生動物遺傳，尤其是瀕危野生動物，如大熊貓、虎、熊等的遺傳學研究中，非損傷性取樣仍然是主要取樣方法[17-18，51-52]。通過嚴格的試驗技術、適用于糞便DNA位點的篩選，糞便DAN樣品的弊端大為減少。Zhang等[53]收集黑龍江省東北虎林園的虎血液以及糞便樣品并提取DNA，血液DNA作為陽性對照進行12個微衛星位點的擴增，發現其中8個微衛星位點能穩定擴增，適合用作東北虎(Pantheratigrisaltaica)糞便DNA的研究。隨著非損傷性取樣法的局限性逐漸被打破，使用范圍不斷擴大，結合微衛星等標記技術，通過分析非損傷性遺傳樣本中的核DNA，能夠進行個體鑒定、親緣關系判定、譜系重建、性別鑒定和種群數量評估，這對野生動物種群監測具有重要意義[25，30，54]。

2.2 微衛星標記方法在大型貓科動物研究中的應用

2.2.1 微衛星標記

目前大型貓科動物微衛星標記多借用家貓微衛星標記。這些標記位點最初由Marilyn等[30]設計，后來逐步用于大型貓科動物，尤其是虎的保護遺傳學，大多都選用了其中一些位點進行研究。在對于Primorye Krai地區東北虎的研究中同樣選取這些引物中的10個在東北虎物種具有多態性的位點，識別出12只個體并估測2002—2003年有9—19只個體棲息于此[55]。對其中一些位點進行修飾后可設計多重分型體系，應用于大型貓科動物的研究，減少工作量之余還可減少對模板DNA的消耗[56]。在選擇標記位點時，選取這些位點與其他大型貓科動物的微衛星位點甚至線粒體位點共同使用也廣泛應用對大型貓科動物的研究[56]。

除此之外，還有為某些特定物種大型貓科動物的引物也被證明在其他大型貓科動物中同樣具有多態性得到了廣泛應用，如蘇門答臘虎(Pantheratigrissumatrae)設計的微衛星位點引物，被證明在東北虎、豹、獅子上同樣具有多態性[31，57]。為孟加拉虎(Pantheratigristigris)研究設計的微衛星標記位點，在隨后的其他虎例如東北虎的研究中也有應用[53，58]。

2.2.2 種群數量調查

通過個體識別可了解野外種群的大小，是保護工作的重點和基礎，只有了解種群大小，才能制定合理的保護計劃。利用糞便DNA使用微衛星標記對大型貓科動物野生種群遺傳學監測在世界各地的保護區以及國家公園都有應用。在印度西高止山脈的虎豹種群數量研究中，通過糞便DNA識別出18只虎和39只豹[59]。尼日利亞Yankari Game 保護區和Kainji Lake國家公園內自2008至2010年收集獅子的糞便樣本進行個體識別以及遺傳多樣性監測，在來自Yankari Game 保護區的樣品中識別出10只個體(7只雄性，3只雌性)，Kainji Lake國家公園的樣品中識別出8只個體(2只雄性，3只雌性，2只未知)[60]。Rozhnov 等[61]利用保護遺傳學方法分析了Primori西南部東北豹(Pantherapardusorientalis)的種群結構，2010—2012年收集的樣品中鑒別出23只個體，并分析了其種群遺傳結構。Wang等[43]在琿春國家級自然保護區收集55份東北虎糞便樣品以及一份毛發樣品，從中鑒定出7只個體(2只雄性，4只雌性，1只性別未知個體)，同時還發現中國東北虎種群遺傳多樣性低于俄羅斯東北虎種群遺傳多樣性，可能是中國東北虎種群較小而導致的。通過個體識別了解種群大小、性別比例等，可以結合種群遺傳多樣性參數對種群未來發展進行一定的預測。

2.2.3 遺傳多樣性檢測

遺傳多樣性是指種內基因的變化，亦稱為基因多樣性。種內的多樣性是物種以上各水平多樣性的重要來源[62]。種群遺傳多樣性是遺傳多樣性的重要體現，表現了一個物種的進化潛力和抵御不良環境的能力。遺傳多樣性越高，該群體對于環境的適應能力就越強，更容易在變化的環境中生存[63]。Wu 等[64]利用16個家貓微衛星引物以及4個蘇門答臘虎微衛星引物對20只動物園繁殖東北虎進行遺傳多樣性以及親緣關系檢測，發現這些東北虎雜合度高，并且遺傳多態性高。津巴布韋Savé Valley保護區收集樣品進行種群遺傳學監測，該保護區種群2005年曾減少到5—10只個體，重新引入10只個體后2016年已經恢復到200只以上。利用11個微衛星位點識別出42個個體，雖然個體數量較多，但遺傳多樣性較低，出現了近交現象，需要再次引入個體[65]。通過種群遺傳多樣性的研究可對種群遺傳的基本情況有所了解，對于制訂保護計劃也十分重要。

2.2.4 種群遺傳結構分析

目前，大多數貓科動物都面臨著棲息地破碎化這一嚴峻的生態問題，棲息地破碎化是許多保護問題的根源所在。棲息地破碎華對于其居于其中的動物影響最嚴重的就是破碎的棲息地阻止了基因交流，遺傳豐富度降低，廊道和景觀連通可以改善這種情況[66]。Sorokin 等[58]使用分損傷性取樣方法進行分子遺傳分析在Ussuriskii國家保護區、Udegeyskaya Legenda國家公園和Khabarovskii Krai收集樣品，利用9個微衛星標記位點從256份糞便樣品、7份毛發樣品、11份血液樣品中識別出63只東北虎個體，并進行種群遺傳結構分析。來自Khabarovskii Krai的樣品和Udegeyskaya Legenda國家公園的樣品屬于同一種群，而來自Ussuriskii國家保護區的樣品屬于另一種群。對于獵豹進行種群遺傳學調查中，利用14個微衛星標記位點，發現博茨瓦納不同地區的獵豹之間存在著一定的遺傳分化，并且雄性比例高于預期[67]。Wultsch等[68]選取5個取樣點采集美洲豹、美洲獅和豹貓(Prionailurusbengalensis)樣品共計1 053份利用14個微衛星位點擴增進行遺傳監測，觀察到3個物種均顯示出遺傳分化，表明棲息地破碎化已對這3種動物的基因交流產生了影響。Terai 景觀弧跨越印度與尼泊爾兩國，兩國均對本國境內景觀弧區域孟加拉虎種群進行了遺傳結構分析。印度區域內收集孟加拉虎遺傳樣品71份，利用13個微衛星位點進行擴增，發現該區域內兩個保護區中孟加拉虎種群基因流受阻，已經產生分化，需采取措施減少人為干擾[69]。尼泊爾區域內的孟加拉虎進行種群遺傳分析，收集該區域內5個保護區以及6個可能的廊道中412份孟加拉虎遺傳樣品，利用8個微衛星標記識別出78只個體，這些個體中有3—7只具有移動性，形成了3個遺傳種群并具有中度分化，基因流同樣受阻，需進一步規劃對Terai 景觀弧進行保護以加強基因流動[70]。由以上文獻可以發現由于棲息地破碎化，幾乎所有大型貓科動物的基因交流都受到了阻礙，產生了遺傳分化。加強廊道的保護，減少棲息地破碎化對于基因交流的影響對于大型貓科動物保護十分重要。

3 未來應用與挑戰

微衛星標記技術在貓科動物的保護工作中使用十分普遍，具有不可替代的地位。在監測野生動物種群遺傳多樣性、種群大小、種群結構以及諸多其他方面均發揮有重要作用。微衛星標記的方法具有諸多優點，但是應用中仍有一些缺陷。首先，雖然微衛星擴增片段有許多短片段，但是在野生動物的研究中分型成功率并不高[70]，主要是因為糞便樣品DNA濃度低，并且在含有食物以及微生物的DNA以及其他雜質。其次，微衛星位點的選擇頗多，許多針對相同物種的研究選取的微衛星位點僅有少量相同而不能進行充分的結果比較[43，51，58-59]。目前大型貓科動物使用的微衛星標記多為二堿基重復，在PCR過程中易發生滑動而現錯誤[71]，需要每批次分型時設置可以穩定擴增的樣品進行矯正。即使選擇相同位點，沒有矯正樣品的數據也不能合并分析。并且，目前微衛星分型沒有統一的標準，分型結果也不能如同DNA序列一樣上傳至數據庫共享數據。缺乏數據的可比性嚴重制約了微衛星標記的應用。

目前已有許多針對糞便DNA提取與保存的研究[72-73]，隨著提取DNA方法的改進，糞便樣品DNA擴增成功率將大為提高。二代測序技術已經趨于成熟，許多大型貓科動物的基因組序列也已經發表，位點篩選的工作量與傳統方法相比將大為減少[74-75]。設計擴增目的片段更短的四堿基重復片段將大為減少滑動而出現的錯誤[76]。另外，進一步統一分型標準也將增進微衛星分型數據的可比性。

現有的研究已有許多微衛星標記結合其他研究方法。結合線粒體DNA標記進行研究，相比于單純使用微衛星標記，具有更高的可信度，常用于種群遺傳監測以及構建進化樹的研究中[57]，結合宏觀生態學數據如空間地理坐標可以研究如遺傳距離與地理距離的關系[77]。未來在大型貓科動物的研究中，使用單一微衛星標記方法所提供的信息已不能滿足對于大型貓科動物種群的研究，結合其他標記方法將成為微衛星標記研究的主要方向，如結合對糞便進行食性研究可監測個體取食情況，結合糞便中各項生化指標監測個體的激素水平等。針對不同的目的選擇合適的方法與微衛星標記相結合，可以更好地監測野生動物種群動態。