丁酸梭菌的培養(yǎng)、鑒定、檢測(cè)方法研究進(jìn)展

張吉鹍

（湖北博大生物股份有限公司，黃石 435000）

1 丁酸梭菌活菌制劑是禁抗之后重要的腸道保健劑

對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行消化、吸收并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，是動(dòng)物腸道的重要功能。所以，進(jìn)行腸道保健、維持腸道健康，尤其在禁抗之后，就顯得非常必要。目前，市場(chǎng)上有關(guān)腸道保健的產(chǎn)品很多，主要以酸化劑、益生菌、中短鏈脂肪酸等為主，而中草藥及其提取物、精油、寡糖、纖維、酶制劑、谷氨酰胺等產(chǎn)品亦發(fā)揮著重要作用。就目前的動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐看，所有這些方案中微生態(tài)（益生菌）制劑是重要的替抗方案之一。所謂微生態(tài)制劑（Probioties），又叫益生菌制劑（Probiotics）、活菌制劑（Bigone）。它是運(yùn)用微生態(tài)學(xué)原理，利用對(duì)宿主有益無(wú)害的益生菌，經(jīng)特殊工藝制成的制劑，對(duì)動(dòng)物具有整腸作用，能夠較好地防治動(dòng)物便秘、炎癥、腹瀉，并對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)具有較好的促進(jìn)作用。丁酸梭菌制劑既產(chǎn)芽孢又產(chǎn)酸，具有芽孢桿菌制劑與乳酸菌制劑的優(yōu)點(diǎn)，作為活菌制劑穩(wěn)定性較好，不需包被即能耐受胃酸與膽汁酸以及外界（制粒、貯存等）不良條件，是禁抗之后重要的腸道保健劑之一。

2 丁酸梭菌的培養(yǎng)

大規(guī)模生產(chǎn)下丁酸梭菌制劑的菌體生物量低，是制約其在動(dòng)物生產(chǎn)中推廣普及的主要因素。常用的培養(yǎng)丁酸梭菌的方法有固態(tài)培養(yǎng)法、響應(yīng)面法、混合培養(yǎng)法等。

2.1 固態(tài)培養(yǎng)法

謝全喜等[1]建立的丁酸梭菌固態(tài)培養(yǎng)方法，其關(guān)鍵點(diǎn)在于培養(yǎng)基的優(yōu)化與發(fā)酵條件的優(yōu)化。經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基組成為：豆粕:麩皮為1:1，氯化鈣0.2%；經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵條件為：72h、37℃、接種量5%。所生產(chǎn)的丁酸梭菌活菌數(shù)可達(dá)2.2×108cfu/g。余國(guó)蓮等[2]提出適合丁酸梭菌制劑大規(guī)模生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基起始pH 7.3、溫度37℃、培養(yǎng)時(shí)間24h、接種量3%；最適培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10g、豆粕15g、玉米粉7g、硫酸鎂0.2g、硫酸銨0.2g、磷酸氫二鉀0.5g、碳酸鈣0.3g、蒸餾水1 000mL。

2.2 響應(yīng)面法

響應(yīng)面法（Response Surface Method），又稱(chēng)響應(yīng)曲面法，是通過(guò)對(duì)響應(yīng)曲面及等高線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，采用多元二次回歸方程來(lái)擬合響應(yīng)值與因素之間函數(shù)關(guān)系的一種優(yōu)化統(tǒng)計(jì)方法，其優(yōu)點(diǎn)是在實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化過(guò)程中可以連續(xù)地對(duì)實(shí)驗(yàn)因素的各個(gè)水平進(jìn)行分析，克服了正交實(shí)驗(yàn)[3,4]只能對(duì)一個(gè)個(gè)孤立的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析和不能給出直觀圖形的缺陷，所以被廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵條件的優(yōu)化和模型的建立[5,6]。徐瑩等[7]利用響應(yīng)面法優(yōu)化丁酸梭菌清液發(fā)酵工藝，將丁酸梭菌的生物量由6.96×107cfu/mL提高到3×108cfu/mL。孔青等[8]采用中心組合實(shí)驗(yàn)（Central Compose Design,CCD）優(yōu)化丁酸梭菌淀粉培養(yǎng)基，最終將生物量提高到2.55×108cfu/mL。李雯靜等[9]對(duì)從健康羊糞便中提取到的一株具有良好益生特性和抗逆性能的羊源丁酸梭菌（命名為HDRyYB1菌株）的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，其發(fā)酵培養(yǎng)基組分（質(zhì)量體積比）為：面粉3.72%、魚(yú)粉0.90%、米粉3.96%、酵母粉0.60%、NaCl 0.19%、MgSO4·7H2O 0.19%、KH2PO40.01%、NaHCO30.01%、CaCO30.48%；其培養(yǎng)參數(shù)為：37℃，初始pH7.2～7.4，瓶裝量100/250，接種量3%。經(jīng)此優(yōu)化后，HDRyYB1菌株發(fā)酵完全（18h）的芽孢數(shù)可達(dá)1.478×108cfu/mL，是優(yōu)化前的2.7倍。經(jīng)李雯靜等[9]優(yōu)化用于發(fā)酵的培養(yǎng)基，具有兩個(gè)顯著特點(diǎn)：一是以米粉、面粉等淀粉質(zhì)原料作為碳源，來(lái)源廣，價(jià)格便宜；二是以魚(yú)粉、酵母粉等有機(jī)氮作為氮源，蛋白質(zhì)、多肽和游離氨基酸的含量豐富，不僅為丁酸梭菌的快速生長(zhǎng)提供了營(yíng)養(yǎng)，也為丁酸梭菌后期芽孢的快速產(chǎn)生提供了營(yíng)養(yǎng)。試驗(yàn)表明，丁酸梭菌經(jīng)18h時(shí)培養(yǎng)后芽孢完全成熟，這為進(jìn)一步用于大規(guī)模生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支撐。邢宏觀等[10]首先采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，即利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出影響丁酸梭菌菌體數(shù)的顯著性因素，從而對(duì)影響丁酸梭菌生物量發(fā)酵液的相關(guān)組分進(jìn)行初步優(yōu)化；然后在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用最陡爬坡試驗(yàn)找出中心組合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，并確定可降低生產(chǎn)成本的非顯著因素的最低添加量；最后運(yùn)用響應(yīng)面分析法進(jìn)一步優(yōu)化丁酸梭菌的發(fā)酵配方，從而獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分，并確定最佳培養(yǎng)條件。其試驗(yàn)結(jié)果表明，酵母浸粉、FeSO4與K2HPO4是影響菌體數(shù)量的3個(gè)顯著性因素；最佳培養(yǎng)基組成為：可溶性淀粉2%、酵母浸粉6%、FeSO41.74%、K2HPO40.37%、NaCl 0.2%、MgSO40.024%；其菌體數(shù)可達(dá)1.01×109cfu/mL，較優(yōu)化前的2.3×108cfu/mL提高了4.39倍。

2.3 與酵母菌混合培養(yǎng)

丁酸梭菌是一種嚴(yán)格厭氧菌，培養(yǎng)時(shí)對(duì)氧極其敏感。生產(chǎn)中常采用往培養(yǎng)基中添加還原性耗氧劑如谷胱甘肽還原鹽或者依靠厭氧生物反應(yīng)器來(lái)達(dá)到厭氧的目的。鄧慶等[11]結(jié)合動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)際，對(duì)丁酸梭菌的培養(yǎng)方法進(jìn)行了創(chuàng)新，首次采用生物除氧（如將酵母菌與丁酸梭菌混合培養(yǎng)）的方法培養(yǎng)丁酸梭菌。酵母菌為兼性厭氧菌，易于培養(yǎng)且生長(zhǎng)迅速，在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用較悠久。酵母的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，不僅富含蛋白質(zhì)（約占酵母干物質(zhì)總量的一半），且富含人體必需氨基酸，尤其是富含谷物食品、飼料中較為缺乏的賴(lài)氨酸。此外，還含有大量的維生素B1、維生素B2及尼克酸。所以，酵母作為常用的飼用益生菌，不僅可以為飼養(yǎng)動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)，還能預(yù)防和治療動(dòng)物的腸道損傷。鄧慶等[11]比較了添加無(wú)機(jī)還原除氧劑硫代硫酸鈉、有機(jī)還原除氧劑半胱氨酸和丁酸梭菌與酵母菌混合培養(yǎng)3種方法對(duì)提高丁酸梭菌的生物量的影響。發(fā)現(xiàn)：①隨著除氧劑添加量的增加，除氧效率不斷提高，當(dāng)硫代硫酸鈉和半胱氨酸的添加量達(dá)到0.004g/mL時(shí)，丁酸梭菌的生物生長(zhǎng)量分別達(dá)到最大值3.49×108cfu/mL與4.24×108cfu/mL；當(dāng)除氧劑的添加量超過(guò)0.004g/mL時(shí)，反而抑制丁酸梭菌的生長(zhǎng)（原因是除氧劑不能持續(xù)地除氧，到培養(yǎng)末期其除氧效果幾乎為零）。②以酵母膏胨葡萄糖為培養(yǎng)基，丁酸梭菌與酵母菌按不同比例接種后混合培養(yǎng)可產(chǎn)生正組合效應(yīng)。當(dāng)丁酸梭菌與酵母菌的體積比為3:7、其相應(yīng)的生物量比為0.517時(shí)，組合效應(yīng)值最大，此時(shí)丁酸梭菌的生物量可達(dá)到5.238×107cfu/mL，酵母菌的生物量為1.68×106cfu/mL。

3 丁酸梭菌的鑒定

3.1 菌株富集與分離純化

歐陽(yáng)志周等[12]將從不曾使用過(guò)任何抗生素及微生態(tài)制劑的仔豬腸道內(nèi)容物中采集的樣品（1g）放入100mL富集培養(yǎng)基藍(lán)蓋瓶中，在80℃熱激10min，用水冷卻后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱富集培養(yǎng)3d，挑選有大量氣泡生成的培養(yǎng)液，進(jìn)一步在富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集，傳代5次后，將檢測(cè)到有丁酸生成的發(fā)酵液轉(zhuǎn)接到分離培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。取富集培養(yǎng)的發(fā)酵液在厭氧培養(yǎng)箱里梯度稀釋到10-8，利用滾管技術(shù)方法分離單菌落。李永峰等[13]則是將樣品于37℃靜置富集培養(yǎng)，采用亨蓋特滾管法對(duì)乙酸產(chǎn)量高的富集物進(jìn)行分離純化。

3.2 形態(tài)學(xué)觀察

在進(jìn)行丁酸梭菌的形態(tài)學(xué)觀察時(shí)，先將鑒定為丁酸梭菌的菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后在TSN瓊脂平板上觀察其菌落形態(tài)。歐陽(yáng)志周等[12]在對(duì)分離到的丁酸梭菌進(jìn)行形態(tài)鑒定時(shí)，依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]中規(guī)定的方法，利用芽孢染液染色、鏡檢。選取菌落形態(tài)和顯微形態(tài)均符合丁酸梭菌培養(yǎng)特征的菌株進(jìn)行16S rDNA序列分析鑒定。

3.3 生理生化特征分析

由于丁酸梭菌隸屬梭菌屬，鑒定丁酸梭菌時(shí)可根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)第8版》中鑒定梭菌屬的方法，采用光學(xué)顯微鏡以及掃描電鏡觀察細(xì)菌的顯微結(jié)構(gòu)，然后結(jié)合生理生化試驗(yàn)，對(duì)菌株鑒定到屬。

3.4 菌株16S rDNA 序列分析

李清揚(yáng)等[15]采用Hungate厭氧操作技術(shù)，從東北地區(qū)土壤中分離到一株產(chǎn)耐低溫淀粉酶菌株C-9，經(jīng)形態(tài)、生理生化、16S rDNA 序列分析，鑒定為丁酸梭菌。李圣杰等[16]對(duì)從雞小腸表面黏液中分離到的既產(chǎn)酸又高產(chǎn)淀粉酶的菌株進(jìn)行生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，確定該分離菌株為丁酸梭菌。遲雪等[17]對(duì)從豬牛糞堆肥、玉米地土壤和腐木混合物的富集樣品中分離到一株降解纖維素的厭氧產(chǎn)丁酸菌，經(jīng)16S rDNA序列分析等鑒定為丁酸梭菌。胡小紅等[18]從窖泥中分離到一株能利用乳酸產(chǎn)丁酸的菌株BEY8，基于16S rDNA基因序列分析鑒定為梭菌屬。樊曉璐等[19]采用厭氧培養(yǎng)法從朗姆酒發(fā)酵過(guò)程添加的丹多液中分離到9株純菌株，經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列分析從中鑒定出1株丁酸梭菌Y-1。王騰浩等[20]采用厭氧培養(yǎng)法進(jìn)行菌種分離，孔穴瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌活性篩選，并通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16S rDNA基因序列同源性分析進(jìn)行菌種鑒定，篩選出產(chǎn)高效抑菌蛋白的丁酸梭菌ZJU-F1。歐陽(yáng)志周等[12]用梭菌強(qiáng)化培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)從仔豬腸道內(nèi)容物中分離獲得的菌株，將其確定為梭菌屬（厭氧條件下產(chǎn)芽孢），再通過(guò)16S rRNA同源性分析進(jìn)一步確定該分離菌株為丁酸梭菌，命名為C. butyricum QL-1。

3.5 將多種方法集成，進(jìn)行整體鑒定

丁酸梭菌自身的特點(diǎn)決定了現(xiàn)有的單一鑒定方法在其鑒定過(guò)程中不可能獲得準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，為準(zhǔn)確鑒定丁酸梭菌，目前傾向于將表型（菌落形態(tài)和革蘭染色等）、生化（API 20A和VITEK2等）、16S rRNA序列分析與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOFMS）等技術(shù)進(jìn)行集成，進(jìn)行全面的整體鑒定以獲得最終鑒定結(jié)果[21]。鑒定周期長(zhǎng)是目前梭狀芽孢桿菌鑒定的主要問(wèn)題，熒光PCR法在細(xì)菌鑒定領(lǐng)域的普及，極大地節(jié)省了鑒定的人力物力，并縮短了試驗(yàn)周期。董銀蘋(píng)等[22]針對(duì)梭狀芽孢桿菌基因序列中屬的特異性與種的特異性基因設(shè)計(jì)引物和探針，優(yōu)化熒光PCR法反應(yīng)參數(shù)與反應(yīng)條件，并用標(biāo)準(zhǔn)菌株、分離株和牛奶樣品對(duì)方法的準(zhǔn)確性與靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)所建立的梭狀芽孢桿菌鑒定用熒光 PCR法在屬和種的鑒定上均有較好的準(zhǔn)確性和靈敏度，可用于梭狀芽孢桿菌的快速、準(zhǔn)確鑒定。

4 丁酸梭菌所產(chǎn)芽孢數(shù)量的檢測(cè)

丁酸梭菌為極其嚴(yán)格的厭氧菌，對(duì)培養(yǎng)條件要求非常苛刻，特別是在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)效果極差。若采用常規(guī)的滅活營(yíng)養(yǎng)體再通過(guò)涂布平板法計(jì)算芽孢數(shù)量不但培養(yǎng)周期長(zhǎng)，而且試驗(yàn)結(jié)果誤差大，不具可行性。因此，要準(zhǔn)確測(cè)定丁酸梭菌所產(chǎn)芽孢的數(shù)量是一個(gè)極富挑戰(zhàn)性的難題。邢宏觀等[10]通過(guò)測(cè)定丁酸梭菌所產(chǎn)芽孢中特定的物質(zhì)2,6-吡啶二羧酸（DPA）的含量來(lái)間接測(cè)定丁酸梭菌所產(chǎn)芽孢的數(shù)量。DPA為僅存于芽孢中的一種特有物質(zhì)，占芽孢干重的5%～14%[23,24]，因此，完全可以通過(guò)測(cè)定DPA含量來(lái)間接測(cè)定芽孢含量。DPA含量的測(cè)定主要有熒光顯色法[25]、質(zhì)譜法[26]、化學(xué)顯色分光光度法[27]和高效液相色譜法[28]等。邢宏觀等[10]比較了分光光度法、熒光顯色法和高效液相色譜法3種方法，發(fā)現(xiàn)高效液相色譜法較其他兩種檢測(cè)方法的靈敏度更高，最后決定采用高效液相色譜法來(lái)測(cè)定芽孢中DPA的含量，并參照Fichtel[29]一文中所測(cè)定的梭菌屬單個(gè)芽孢DPA含量標(biāo)準(zhǔn)（每個(gè)芽孢中DPA的含量大概為2.2×10-16mol）將最終DPA濃度換算成芽孢數(shù)。

5 丁酸梭菌抗逆性及其安全性的測(cè)定

丁酸梭菌抗逆性檢測(cè)包括耐高溫、耐酸與耐膽汁試驗(yàn)。安全性試驗(yàn)通常以小鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，參照GB15193.3-2003最大耐受劑量法進(jìn)行。