檢驗豬場免疫效果的方法

朱連德

（北京中科基因技術有限公司，北京 海淀 100081）

效果評估疫苗免疫已成為豬場疫病防控的主要手段，盡管非洲豬瘟令養豬從業者和獸醫的生物安全意識有了很大改變，但豬場對疫苗的期盼和依賴度依然很高，疫苗免疫成為豬場生物安全的最后一道防線。不管是已用疫苗的維持還是新疫苗的應用都需要免疫效果檢驗結果的支持。豬群接種后必須及時了解免疫是否合格，免疫的時機是否準確，免疫的次數和間隔是否合適，產生的免疫應答抗體是否足以抵抗外來病原微生物的侵害。如果這些問題都不清楚，養豬生產就會存在隱患。若豬群免疫無效或不合格，養豬從業者或獸醫需知道應根據哪些指標或參數對疫苗選擇和免疫程序修正做出決策。這需要從臨床、生產到實驗室數據的有效監控，正確檢驗、評估疫苗免疫效果。免疫效果需要利用多種方法綜合檢驗評估而不是單一的方法，掌握這些方法不難，重要的是如何利用這些方法真實地反映出疫苗的有效性和免疫效率。

1 臨床觀察和生產成績比較

這是最為經典和樸素的疫苗效果檢驗方法。豬場疫苗免疫后1月、3月、6月乃至1年，對應疫苗的疾病臨床發生率大大下降或不再發生，生產成績比應用疫苗之前明顯提高，那能不能說疫苗免疫是有效的呢？通常人們會說是有效的，但考慮到豬場疫病發生、發展的規律及生產中采取的其他措施或環境、氣候的改變，很難就疫苗免疫效果下結論。這是在肉眼觀察和生產記錄的基礎上，做出的粗略估計。

2 臨床對比試驗

將生活在相同環境中的一批豬分成2組，一組用疫苗，另一組不用疫苗，以此對比方法檢驗疫苗是否有效。有的豬場可能連續對比2批或更多批的豬來評估疫苗效果。在生產過程中，尤其是新疫苗上市時，人們通常采用這樣的方法評價疫苗效果并決定是否選擇應用這個疫苗。很多疫苗企業在新產品上市后，會動員豬場做平行對比試驗，免疫豬群與同等年齡和同樣環境下的未免疫豬群比較，以此來證明疫苗的有效性。如果免疫豬群相對于未免疫豬群臨床癥狀輕微或沒有，生產成績較好，通常認為免疫是有效的。可是即便免疫效果有效，那免疫效率如何，有多少豬產生了有效抗體，免疫保護率是多少，有效抗體能持續多久，對比試驗依然不能明確回答這些問題。

3 哨兵豬試驗

某些豬群，如后備豬群在免疫后，免疫應答反應是否抑制了其排毒，可以通過哨兵豬投入豬群后予以驗證。哨兵豬是易感者，在免疫豬群中1周乃至數周沒有相應疾病的臨床癥狀，則說明疫苗免疫減少或消除了豬群病毒血癥，豬群不再排毒或不具備感染能力。考慮到哨兵豬健康狀況、環境等因素影響，這種試驗也只能是養豬生產上的一種粗略評估，通常用于免疫凈化方案實施的豬場。豬藍耳病弱毒疫苗免疫的陽性豬場，盡量不要用哨兵豬試驗方法。除了臨床觀察、生產成績對比等之外，還有一種在實驗室中檢驗疫苗免疫效果的方法，那就是攻毒試驗。但在豬場內是斷不可以這樣做的，這會給養豬生產帶來非常大的風險。

4 抗體檢測

一般完成免疫接種程序后，可以通過檢測血液中的抗體水平判斷疫苗接種的效果，目前常用的有以下幾種。

4.1 正向間接血凝試驗(IHA)

其原理是將抗原(或抗體)包被于紅細胞表面，成為致敏的載體，然后與相應的抗體(或抗原)結合，從而使紅細胞拉聚在一起，出現可見的凝集反應。目前已有商用試劑盒，可以按說明書操作。豬瘟、豬口蹄疫抗體的檢驗均可采用此法。豬瘟弱毒疫苗免疫后血清血凝效價（或者說抗體水平）≥1∶16為免疫合格；豬口蹄疫滅活疫苗免疫后血清血凝效價≥1∶128為免疫合格。該方法也可以用于豬細小病毒抗體和豬流感病毒抗體的測定和檢驗。

4.2 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

4.2.1 間接ELISA

其原理是將抗原連接到固相載體上，樣品中待測抗體與之結合成固相抗原受檢抗體復合物，再用酶標二抗（針對受檢抗體的抗體）與固相免疫復合物中的抗體結合，形成固相抗原-受檢抗體-酶標二抗復合物，用分光光度計定量測定加底物后的顯色程度，確定待測抗體含量。目前已經用于豬藍耳病病毒抗體、豬瘟病毒抗體、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌抗體的檢測。百測（Biochek）對豬偽狂犬病gB和豬圓環病毒抗體的檢測用的也是這種方法。

4.2.2 阻斷ELISA

該方法是用抗原包被固相載體，加入待檢樣品，然后加入酶標單克隆抗體，最后加底物顯色。呈色反應的深淺與樣品中的抗原呈反比，主要用于測定抗體。豬瘟、豬偽狂犬病gE、豬口蹄疫、豬流感病毒抗體、豬傳染性胃腸炎抗體檢測均可用此法。

4.2.3 雙抗原夾心ELISA

原理是將抗原固定在固相載體表面，抗體一個臂與該固定抗原結合，另一個臂與酶標或者金標的抗原結合，形成抗原-待檢抗體-標記抗原的“夾心”，經顯色劑顯色，測出抗體水平。可用于豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒抗體等的檢測。

4.3 血清中和試驗（SNT）

這是一種用已知病毒測定血清中特異性抗體的方法。豬瘟、豬偽狂犬病、傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉等病毒抗體檢測應用此法。目前商用ELISA試劑盒愈來愈多，操作方便，比較廣泛地應用于疫苗免疫后抗體水平檢測。

5 病原檢測

疫苗免疫后，豬群是否存在病毒血癥或菌血癥，唾液、鼻分泌物、尿液、糞便等分泌和排泄物是否有病原，排毒持續多久，這也是評估疫苗免疫效果的方法之一。

5.1 PCR（聚合酶鏈式反應）方法

這是一種用于放大、擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，該技術將微量的DNA大幅增加。包含普通PCR、RT-PCR、RealTime PCR等。DNA病毒使用PCR，RNA病毒提取核酸后需要反轉錄，即RNA病毒使用RT-PCR。二者均可使用熒光PCR進行檢測，大大提高檢測的靈敏度。現在研發出一些常溫下操作的快檢設備。豬藍耳病、豬瘟、豬偽狂犬病、豬圓環病毒、非洲豬瘟等病毒均可使用PCR方法檢測。目前非洲豬瘟的檢測診斷主要是熒光定量PCR的方法，尚沒有非洲豬瘟疫苗，便也談不上檢驗評估了。

5.2 生物芯片

其是指采用光導原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子，比如核酸片段、多肽分子甚至細胞等生物樣品有序地固化于支持物的表面，然后與已標記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數量。現在有生物芯片檢測豬瘟、豬口蹄疫、豬偽狂犬病、非洲豬瘟、豬流行性腹瀉病毒等，市場上也出現了高通量、現場檢測的數字化生物芯片。

5.3 膠體金檢測

常用的是“膠體金免疫層析法”，在檢測帶上可通過肉眼觀察到顯色結果。該法現已發展成為診斷試紙條，使用方便。膠體金技術適于豬瘟、豬口蹄疫、豬偽狂犬病、豬流行性腹瀉病毒等血、尿液或糞便的檢測，現在豬藍耳病病毒、豬圓環病毒的膠體金檢測試劑盒以及多聯檢的膠體金試劑盒也已開始使用。

5.4 ELISA雙抗體夾心法

連接于固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中待檢抗原分子上2個抗原決定簇結合，形成固相抗體-待檢抗原-酶標抗體免疫復合物，加入該酶的底物后生成的有色物質量(OD值)，即可確定待測抗原含量。可用于豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒等檢測。此外，還有對豬體免疫系統檢測的方法，譬如對細胞免疫應答的檢測，干擾素、免疫細胞、免疫因子的變化，可以反映疫苗免疫應答情況，但目前主要在實驗室研究用，尚未用于豬場生產的臨床實踐。

6 總結

上述檢測方法中如今有不少商品化試劑盒和快檢設備可用，并且隨著第三方獨立檢測機構的出現，疫苗免疫效果的檢驗、評估也越來越專業、高效。作為豬場獸醫或專家須科學、合理地制定試驗方案、采樣計劃，正確地采樣和處理樣品，應用規范、正確的結果分析方法和判定標準。豬場疫苗免疫效果受疫苗質量、豬體免疫反應、其他疫苗與疾病的干擾、免疫時機和免疫操作等因素影響，在實際生產中，通過臨床和生產成績來確切地評估疫苗的免疫效果是不容易的，應該在豬群免疫后分2個、3個甚至更多時間段采樣檢測。采樣設計是很關鍵的，譬如在檢測群豬的抗體時，應在免疫時間軸上，選擇2個或更多時間點采樣檢測抗體以了解抗體產生、消長變化。檢測抗原，要注意避開弱毒疫苗病毒血癥時間采樣檢測病原。

有些疫苗如豬圓環病毒疫苗免疫后，檢測是否存在病毒血癥，僅這一個參數是無法評定疫苗保護效果的。所以豬場應根據不同種類、不同性質的疫苗，確定不同的檢驗評估、實驗室檢測方法和相應的檢驗、評估參數，如發病率、死亡率、日增重、抗體/抗原陽性率、抗體合格率、合格抗體持續時間、變異系數CV值、排毒時長、循環Ct值等中的多個或全部參數。檢驗檢測的方法很重要，豬場在選擇試劑盒后，一定要清楚試劑盒適合的條件，不同試劑盒的靈敏度、特異性和穩定性等。此外，實驗室檢測是一個體系，實驗室的環境條件、檢測的標準操作程序（SOP）、檢測方法、檢測人員能力、檢測用耗材試劑、儀器設備等都要合格、配套，僅注重精密和貴重儀器設備是不行的。疫苗免疫效果包含疫苗的有效性和免疫效率2個方面，因此豬場疫苗效果檢驗、評估，不能僅憑直覺、憑經驗、憑肉眼觀察和憑疫苗的口碑，應有真實的臨床數據，正確的實驗室檢測數據，科學的分析評估標準，做到真正量化評估指標，使得豬群免疫管理和健康管理數字化和更加科學化。