重組梅毒螺旋體診斷抗原的研究進展

王斯倩,符 波,趙宇龍,廖夢佳,李長清,曹龍古,曾鐵兵

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)感染引起的一種慢性多階段發展的性傳播疾病,嚴重危害成人與新生兒身心健康。目前尚無疫苗進行特異性預防,早診斷對防控梅毒意義重大。梅毒臨床表現十分復雜,需依靠實驗室檢測以明確診斷,其中以血清學方法為主,尤其是檢測特異性Tp抗體。最早以Tp全菌作為診斷抗原,但獲取Tp抗原困難,且與其他密螺旋體有交叉抗原。近十余年來,基于重組診斷抗原的血清學方法大力促進了特異、快速、精準的梅毒血清學診斷的發展。但目前應用的重組抗原仍不能有效診斷早/晚期梅毒,或區分不同感染階段,或療效判斷[1],需進一步尋找其他抗原。本文綜述傳統重組Tp膜脂蛋白及部分新型候選抗原在梅毒診斷中的應用價值及局限性,并進一步討論最佳候選抗原的條件。

1 Tp分子生物學特征

1.1 基因組特征Tp無質粒,染色質基因組非常小。Tp全基因組同源性比對發現[2],Tp基因有約43%的開放性閱讀框(ORF)未找到與之匹配的數據庫,可能為功能不明的新基因[3]。Tp缺乏多種參與代謝的酶類[4],體外培養困難,不能進行基因操作,成為阻礙這些功能不明基因功能研究的主要瓶頸。

1.2 蛋白質組與免疫蛋白質組特征 先后應用SDS-PAGE、二維凝膠電泳(2DGE)[5]及互補質譜技術[6],發現Tp蛋白質組主要特征有:Tp外膜蛋白密度非常低(僅為大腸埃希菌外膜蛋白的1%),主要包括有種特異性、由12種蛋白組成的Tpr蛋白家族,以及一些暴露于膜表面的蛋白(最初以TROMPs命名,現主要根據ORF序列來命名,如Tp0326、Tp0453)。此外,位于周質間隙的鞭毛蛋白(傳統上被命名為Fla)在Tp中表達量非常高[7]。Tp還存在大量脂蛋白,大多位于Tp的細胞內膜,脂蛋白基因表達水平也高[8]。

能夠引起宿主免疫應答,并可與梅毒患者血清反應的蛋白統稱為Tp免疫蛋白組。Brinkman[9]與McGill[5]應用免疫蛋白質組技術,分別從Tp重組蛋白表達文庫和感染兔睪丸獲取的Nichols株天然蛋白中,僅檢測到了30余種免疫活性抗原。2個研究發現的免疫反應性蛋白雖不完全相同,但主要蛋白一致,主要包括一些通常可與不同期梅毒患者血清反應的內膜脂蛋白。該類脂蛋白未暴露于膜表面,但仍可引起高水平的抗體應答,所以均可用做梅毒的診斷抗原,極大地豐富了Tp特異性血清學檢測。同時發現,Tp免疫蛋白質組中很少有位于膜表面的抗原,這限制了對Tp的檢測。2個研究中免疫蛋白質組結果雖不同,但外膜蛋白在免疫診斷中的價值引起了學者們的興趣。總之,免疫蛋白質組的數據表明了Tp免疫原性低,同時也列舉了最具前景的梅毒診斷抗原。

2 重組Tp診斷抗原的基本功能與應用及局限性

2.1Tp膜脂蛋白診斷抗原 檢測特異性Tp抗體最初以天然或經超聲破碎的Tp細胞作為診斷抗原,目前仍用于熒光密螺旋體抗體吸收試驗(FTAABS)、密螺旋體顆粒凝集試驗(TPPA)等試劑盒中。由于Tp無法在體外連續培養,獲取其抗原困難,而且與其他密螺旋體有交叉抗原。近年來,重組蛋白技術極大地促進了Tp血清學診斷的發展。通過大腸埃希菌表達的重組蛋白作為診斷抗原,用于酶聯免疫吸附試驗(ELISA)或者蛋白印跡法(WB)等測定特異性Tp抗體。

最早用作重組診斷抗原的是Tp內膜脂蛋白Tp15(tp0171基因產物)、Tp17(tp0435基因產物)與Tp47(tp0574基因產物),三者均具強免疫原性。Tp15功能仍不明;Tp17為β-桶狀蛋白[10],在維持膜結構、通過激活內皮細胞中表達黏附分子、趨化因子等方面起重要作用[11]。Tp47是一種羧肽酶(青霉素結合蛋白),能促進微血管內皮細胞合成細胞間黏附分子-1(ICAM-1)以及誘導血管間黏附分子[12]。早期的Tp診斷基于單一的重組抗原,Tp15、Tp17和Tp47檢測的敏感性和特異性分別是100%、96%、100%和100%、100%、20%[13],而2種以上抗原組合可提高檢測敏感性,繼而建立了人工嵌合體脂蛋白Tp15-Tp17-Tp47,同時結合ELISA[14]和微型蛋白質芯片技術[15],作為快速簡便的梅毒血清學診斷方法。此外,重組脂蛋白還包括目前被用做診斷抗原的Tmp A(tp0768基因產物)[16]和 Tpp15-Tpp17-Tp44.5-Tp47融合抗原(Meridian Life Science,Inc.,Memphis,Tennessee USA)。少數應用TmpC(tp0319基因產物,嘌呤核苷受體脂蛋白)[17]與MglB-2(tp0684基因產物,甲基半乳糖苷ABC轉運蛋白)做診斷抗原[18]。脂蛋白的抗原組合用于免疫印跡(WB)中,顯示出高度敏感性和特異性[19]。

最新發現的Tp32脂蛋白 (tp0821基因產物)是一種結合L-甲硫氨酸的Tp內膜脂蛋白[20]。該蛋白在Brinkman[9]和McGill[5]的研究中無明顯免疫反應性,但Xie等[20]結果顯示出IgM和IgG的陽性率分別高達91.0%和98.3%,與其他方式的檢測結果一致。以重組Tp0821與萊姆病、鉤端螺旋體病患者以及健康人群血清交叉反應的特異性為94.3%～100%,提示Tp0821經進一步驗證后可作為一類新型的梅毒診斷抗原[20]。

總之,基于重組脂蛋白技術的Tp特異性抗體檢測能使梅毒診斷的特異性和敏感性達95%～99%,但對早、晚期梅毒診斷[21]以及療效判定不太有效,也不能區分梅毒所處的感染階段,而免疫蛋白質組研究結果表明,在感染期間可能針對某些Tp抗原產生不同免疫應答。因此,必須擴大范圍尋找用于梅毒各個感染時期的診斷抗原。

2.2Tp表面暴露蛋白診斷抗原 外膜蛋白是最重要的免疫靶標,但Tp外膜蛋白含量非常少,在Cox的研究中[22]僅確定了17個候選外膜蛋白,包括7個Tpr家族成員、9個非Tpr假定蛋白以及Tp0326(Tp92)蛋白。

Tpr家族蛋白包含了12個蛋白,分為3個亞族。亞族Ⅰ(TprC、Tpr D、TprI、Tpr F)在C端、N端以及中央區域有保守序列,預測大多位于外膜,與膜的滲透性有關。亞族Ⅱ(Tpr E、Tpr G、TprJ)有共同的N端和C端,中間為序列與長度不等的中央區域。亞族Ⅲ(Tpr A、TprB、Tpr H、Tpr K、Tpr L)同源性較低,有不同的可變區,其中Tpr K(tp0897基因產物)有7個可變區,該區是抗體重要的應答靶位,但由于高度異變使Tp逃脫免疫清除[23]。出人意料的是,盡管針對亞族Ⅰ的Tpr蛋白及Tpr K的N端保守區能產生很強的抗體和T細胞應答,但在Brinkman[9]和McGill[5]的免疫蛋白質組研究中均未顯示出免疫反應性,這可能與上述Tpr蛋白的變異性有關,尤其是Tpr K。基于在Tp致病及免疫逃逸中的重要作用,Tpr蛋白家族可用作Tp候選疫苗抗原,但作為診斷抗原具有一定限制性[1]。

非Tpr家族的表面暴露的密螺旋體稀有外膜蛋白稱為TROMPs,包含 TROMP-1(31-k Da)、TROMP-2(28-k Da)及TROMP-3(65-k Da)。在先前的研究中TROMPs和感染兔及梅毒血清反應[24],而Brinkman[9]研究中TROMP-2(Fla A同系物,tp0663基因產物)僅和一期梅毒血清反應。在McGill[5]的Tp蛋白組研究中首次確定了TROMPs蛋白,但WB試驗未顯示出其與梅毒血清反應。目前,Tp0663被確定為新的血清診斷候選抗原,其對于檢測不同階段的梅毒感染具有高度敏感性(98.83%)和特異性 (100%)[25]。

Tp0326(Tp92)也稱為Bam A,為膜表面蛋白,與革蘭氏陰性家族高保守的β-桶狀復合物序列同源[26],其N端有多肽轉運相關結構域(POTRA),C端有β桶狀結構[26]。Brinkman研究中Tp0326顯示免疫反應性[9],但McGill研究中[5]卻不與潛伏期梅毒血清反應,也無免疫原性,這是因為Tp0326在Tp蛋白組中表達量非常少,針對POTRA與β-桶狀結構部分2個表位產生的抗體很少。出人意料的是,Tp感染兔血清均可與這2個表位反應,而人類二期梅毒血清僅對POTRA反應[25]。最近,Luthra[27]研究結果表明Tp0326的β桶狀結構域只有在完整的Tp中才有表面暴露的抗原表位。根據這些結果,基于重組Tp0326、Tp0326與Tp0453組合、Tp0326-0453融合蛋白的梅毒診斷試劑盒已經被開發[28]。

Tp0453蛋白為穿孔蛋白(假想的脂蛋白),位于Tp外膜的內表面,參與脂質與糖脂運載。Brinkman研究中Tp0453無血清反應性[9],但McGill研究中顯示出能與一期梅毒血清反應[5],這個結果與Van Voorhis數據一致[29]:當其與梅毒血清反應時顯示出100%特異性與100%敏感性,而不與回歸熱、萊姆病或鉤端螺旋體病患者血清發生交叉反應。最近,通過p ET28a載體表達得到可溶性Tp0453,基于Tp0453的ELISA診斷試劑盒亦可獲得。基于重組Tp0453及Tp0453-Tp0326融合蛋白的ELISA方法也有報道,兩者的敏感性和特異性分別為98%和98%、100%和99%,這些蛋白均為可用于梅毒血清學診斷的新型候選抗原[28]。目前包含Tp0453與傳統的Tp15、Tp17、Tp47、Tmp A和新型Gpd(Tp0257)抗原的WB試劑盒Recom Blot Treponema IgG/IgM 2.0(Mikrogen Gmb H,Germany)已實現商品化。

2.3Tp黏附素、周質蛋白、鞭毛蛋白診斷抗原Tp0155和Tp0483蛋白是Tp的假定黏附素,能結合纖粘蛋白,但兩者在免疫蛋白組研究中[5,9]并未表現出血清反應性。在與一期梅毒早期感染血清反應時,均僅有9%的患者血清顯示出陽性結果[29]。

Tp0136是暴露于Tp膜外的假定黏附素/脂蛋白,能結合纖粘蛋白和層粘連蛋白。相比細胞纖維蛋白,Tp0136更能有效通過其N端保守區域與血漿纖維蛋白結合[30]。當宿主對Tp應答時,Tp0136轉錄水平很高,可能對Tp持久存活起重要作用。Tp0136在McGill蛋白組研究中無免疫反應性[5],而在Brinkman研究中主要對一期梅毒血清有反應[9]。楊珺等[31]表達分子量為28kDa的可溶性Tp0136活性肽段(Tp0136B),與早期梅毒血清反應的陽性率為85.5%,在一期梅毒診斷中有良好的前景。

Tp0751是Tp重要黏附素,能結合層連蛋白,也是Tp金屬蛋白酶。與其共轉錄的Tp0750是一種絲氨酸蛋白酶,能降解凝塊組分(纖維蛋白原和纖連蛋白)[32],被預測和Tp0751一起發揮作用,與Tp入侵宿主和體內播散有關。盡管Tp0751與Tp致病性有關,但其在上述的2個免疫組蛋白實驗中并未顯示出反應性,在Brinkman研究中[9],對早期潛伏期梅毒血清僅表現出輕微反應性。在一項比較性研究中,相比Tp0257(Gpd)以及Tp1038(Tp F1),Tp0751表現出了更低的血清反應性[28]。雖然在診斷方面有局限性,但它顯示出了很好的免疫保護性,有希望成為一種梅毒候選疫苗分子[33]。

Tp0257(Gpd)與許多病原體的甘油磷酸二酯酶蛋白家族同源,可水解脫酰化磷脂,起初被認為暴露于外膜表面,但進一步研究表明為周質間隙多肽。在Brinkman[9]研究中,Tp0257能與一期、二期及早期潛伏期梅毒血清反應,但McGill研究中未檢測到該蛋白[5]。目前僅有少量關于重組Tp0257和Tp0453一起用于梅毒血清檢測的數據報道[29]。

Tp1038(Tp F1,4D抗原)與鐵元素的吸收有關系,屬細菌鐵蛋白[34]。在Brinkman[9]研究中,Tp1038能與潛伏期梅毒血清反應,在McGill[5]研究中,其寡聚體能與所有期的梅毒血清反應,而單體則不能。Jiang等[34]研究表明,重組Tp1038對所有期的梅毒血清都表現出很高的靈敏性(93.3%～100%),交叉反應顯示出極高的特異性(100%),被認為是一種非常有前景的梅毒診斷候選抗原。

Tp0965為膜融合蛋白,位于Tp周質,能激活內皮細胞,增加單層內皮細胞的通透性[36]。Tp0965在McGill研究中能與各期梅毒血清反應,有潛在的診斷價值。Long等[37]發現重組Tp0965能與臨床各期梅毒血清反應,表現出良好的敏感性與特異性。Runina[38]發現重組Tp0965檢測各期梅毒總的敏感性與特異性分別為98.8%和87.5%,對一期與早期潛伏梅毒的敏感性非常高(達100%)。這些結果提示Tp0965也是一種非常有前景的新型梅毒診斷候選抗原。

鞭毛蛋白是Tp的重要抗原,由軸絲核心蛋白Tp0868(FlaB1)、Tp0792(FlaB2)和 Tp0870(FlaB3)、鞘蛋白Tp0249(Fla A1)、鉤狀基復合蛋白(Tp0398和Tp0727)及馬達蛋白 (Tp0400)構成。Tp0398和Tp0727在Brinkman[9]研究中有血清反應性,Mc Gill[5]結果也表明大部分鞭毛蛋白能與所有期的梅毒血清反應。早期研究發現鞭毛蛋白與螺旋體屬的很多蛋白有交叉反應,這限制了其在梅毒診斷中的應用。Jiang等[39]以重組FlaB1、FlaB2與FlaB3檢測相應IgG有很高的敏感性和特異性,分別達 95.4%、98.9%、92.6% 和 95.8%、95.1%、95.8%,檢測一期梅毒和先天性梅毒相應的IgM敏感性和特異性分別為76.8%和83.1%、72.0%和87.7%、74.4%和89.2%,表明三者也可作為梅毒血清學診斷的候選抗原。為提高特異性,最近Tan等[40]構建Tp的FlaB1、FlaB2和Fla B3保守的N端、C端及中間可變區M肽段,ELISA檢測臨床標本特異性IgG,發現FlaB3的M肽段(B3M)的敏感性和特異性最高,分別為95%和100%,是有希望的候選抗原。

總之,新型重組抗原在梅毒血清學診斷中具有潛在價值,但也存在局限性。例如,某些蛋白 (如Tp0136、Tp0257和Tp1038)對一期和早期梅毒檢測更有價值;相對傳統的Tp免疫優勢脂蛋白,有些蛋白的敏感性(如Tp0155、Tp0483、Tp0751)和特異性(如Tp0868、Tp0792、Tp0870)較低[1]。

3 Tp診斷抗原未來的發展方向

目前的研究表明,很多有望成為提高梅毒血清學診斷效果的新型候選抗原的實際檢測效果遠不如傳統重組脂蛋白,開發新的Tp重組抗原尤為必要。可考慮應用以下策略:針對Tp感染過程中可改變自身生物學行為、在不同感染時期形成不同的蛋白表達譜的特點,應用免疫蛋白質組學(如非標定量Label-free質譜技術結合免疫印跡)等方法技術,以不同感染階段的梅毒患者或感染兔血清篩選某一特定梅毒階段(如早期或晚期或治愈后梅毒)表達的抗原,以其作為該階段的生物標記物檢測相應抗體。篩選理想診斷抗原應符合以下條件[1]:①可檢測的免疫反應性;②在不同梅毒感染階段的表達水平;③感染消除后免疫應答水平下降。通過定量與定性分析其相應抗體水平,可早期診斷和區分不同感染階段的梅毒,判斷梅毒治療效果,同時聯合應用重組抗原(多價融合蛋白或多價表位多肽)以提高檢測的敏感性和特異性[41]。最近,Liu等[42]應用生物信息學分析和兔感染模型鑒定出Tp0971、Tp0768、Tp0462為感染依賴性抗原(Tp在早期感染機體階段合成分泌到菌體胞內外的蛋白抗原),分別基于此3種抗原的ELISA方法均與商品化TPPA和Tp-ELISA試劑盒有很好的一致性,而分析隨訪梅毒患者Tp0971抗體與RPR滴度變化的相關性表明,Tp0971有希望用于梅毒療效的檢測。

梅毒血清學診斷的發展速度已經放緩,但發展Tp重組抗原仍然是多學科生物醫學研究領域面臨的實際任務,需要開展大量的實驗室工作和臨床工作。

利益沖突:無

引用本文格式:王斯倩,符波,趙宇龍,等.重組梅毒螺旋體診斷抗原的研究進展[J].中國人獸共患病學報,2019,35(9):837-842.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.116