缺血性腦血管病的現代研究進展

張業昊，姚明江，劉建勛

(中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所，中藥藥理北京市重點實驗室，北京 100091)

腦卒中是一種常見的疾病，絕大多數腦卒中病例是由短暫性或永久性腦血管閉塞引起的缺血性腦血管病(缺血性中風)，最終導致腦梗死。最終的梗死面積和神經系統結局取決于多種因素，如缺血的持續時間和嚴重程度、側支系統的存在和足夠的全身血壓、梗死的病因和定位、患者年齡、性別等。因此，缺血性中風是一種高度復雜和異質性的疾病。中風的長期表現可以包括抑郁癥、中風后疲勞、痙攣狀態和全身功能喪失，最終導致血管性認知障礙。雖然中風是一種復雜的疾病，但一些常見的特征可以用實驗性中風來模擬。缺血性中風的一個重要組成部分是不斷變化的腦損傷，這是由半影的概念所解釋的。在幾分鐘內，血液供應在基線水平下降15%～20%時，會導致梗死核心不可逆轉地受損，并伴有快速壞死性細胞死亡。在周圍的腦組織中，血流量減少的幅度減小，導致神經元功能喪失，同時維持結構完整性。如果沒有血流恢復，這個所謂的有風險的組織將被納入梗死核心。電活動喪失和不可逆神經元去極化之間的腦灌注范圍，被稱為半暗帶[1]。在臨床試驗中，已經研究了許多策略來改善缺血性中風的腦部搶救和恢復，包括抗氧化策略、神經元保護策略，甚至是抗炎策略。盡管進行了大量的臨床試驗，但由于潛在的不同原因，這些缺血性卒中治療藥物大多數都失敗了，包括所研究患者的變異性和復雜性、脫靶效應、效力不足或臨床前模型不足。盡管一些藥物已經顯示出初步的希望，而其他藥物仍處于臨床試驗階段。因此，探究缺血性中風的病理機制及尋找有效的藥物，是目前亟需解決的問題。

1 缺血性中風與代謝組學的關系

代謝組學是基于特定生物或細胞中終產物的定性和定量分析[2]。1970年，Horning等[3]開始研究代謝物在人體內的代謝譜。1983年，尿樣首次通過氣相色譜-質譜(GC-MS)進行分析。代謝組學研究可以通過揭示代謝網絡和生物標志物，闡明特定的機制。與單獨的單一途徑或單一生物標志物相比，系統性數據更有助于闡明復雜疾病，如腦缺血的發病機制[4]。迄今為止，腦缺血的發病機制與能量代謝、興奮性氨基酸毒性、活性氧(reactive oxygen species，ROS)和炎癥反應有關。這些過程涉及多種代謝物，其定性和定量表達是代謝組學的重點。

常用于腦缺血代謝組學研究的動物包括大鼠、小鼠、沙鼠、兔、狗、貓、猴和豬，其中，大鼠最常使用。迄今為止的研究發現，大鼠腦缺血后的代謝產物主要分為以下5類：氨基酸、核酸、神經遞質、脂質和有機酸。樣品包括血漿、血清、皮層、海馬、紋狀體、丘腦、中腦、白質、松果體和嗅球。在這些組織中，血漿、血清、腦脊液、皮層、海馬和紋狀體得到較好的研究，而其余的樣本研究較少。氨基酸類是最常被發現的變化的代謝產物，研究發現，興奮性氨基酸(excitatory amino acid,EAA)，包括谷氨酸和天門冬氨酸在缺血/再灌注后的1 h內明顯增加[5-6]。Wang等[7]在缺血/再灌注后24 h觀察到血清和腦脊液中谷氨酸水平增加，而其他氨基酸如丙氨酸，動態降低然后增加。腦脊液中甘氨酸和絲氨酸的水平在缺血后6 h內持續下降。然而，并非所有的實驗都表明缺血/再灌注后EAA增加。目前研究已發現20多種在腦缺血模型中發生變化的核酸代謝產物，Irie等[8]使用LC-MS和基質輔助激光解吸/電離-MS(MALDI-MS)技術，檢測再灌注后大鼠皮質、海馬和紋狀體中的20種核酸，并將結果與正常半球進行比較。在皮層和紋狀體中，大部分核酸水平發生明顯變化，而海馬中的水平保持不變。大多數核酸在再灌注后的很長時間內不斷減少。已經提出了兩種理論來解釋這些下降：首先，在缺血早期，EAA的強大合成過程迅速耗盡了核酸庫；其次，參與戊糖磷酸途徑的核糖-5-磷酸脫氫酶的活性在局部缺血時降低，從而降低總核酸水平[9]。

在早期腦缺血研究中，研究人員通常會制備全腦組織勻漿，這些研究的結果顯示了全腦代謝物的平均水平。然而，在不同腦區個別代謝物的表達是不同的。例如，Macrì等[10]發現，海馬體中丙氨酸水平降低，但在皮質中保持穩定。因此，在腦缺血代謝組學研究中，樣本應限制在特定的腦區，以確保識別的生物標記物的準確性。

2 缺血性中風與microRNA的關系

miRNA是小的非蛋白質編碼RNA，其包括通過進化高度保守的20～24個核苷酸。它們是轉錄后調節劑，靶向mRNA的3′非翻譯區(3′-UTRs)，抑制各自mRNA的翻譯或降解[11]。miRNA已牽涉多種細胞過程和疾病，如神經元發育、分化、突觸可塑性、增殖、代謝、凋亡、神經變性疾病和腫瘤的調控。miRNA幾乎在大腦功能的各個方面發揮重要作用，包括神經發生、神經發育和導致突觸可塑性變化的細胞反應。它們還涉及神經變性和神經疾病，對缺氧和局部缺血的應答以及缺血預處理誘導的缺血耐受。在最近的研究中，已經在臨床試驗和動物實驗分別篩查miRNA表達譜，這些研究表明，miRNA已經成為缺血性中風生物學中的關鍵介質。

2.1 microRNA與缺血性興奮性毒性缺血性中風主要通過興奮性中毒損傷腦組織，腦缺血后，突觸間的谷氨酸大量釋放，誘導細胞死亡。谷氨酸是中樞神經系統(central nervous system，CNS)中的主要興奮性神經遞質。在缺血性中風后，miR-107的過表達，導致抑制谷氨酸轉運蛋白-1(glutamate transporter 1，GLT-1)表達和谷氨酸蓄積增加，這決定了興奮性毒性的程度[12]。GLT-1缺血后的下調與谷氨酸的積累密切相關，提示谷氨酸積累和神經元興奮性中毒可通過GLT-1表達來控制[13]。在短暫的前腦缺血后，增加miR-29a保護星形膠質細胞，進而保護神經元。miR-29a導致PUMA(上調凋亡調節劑p53)水平下降，從而抑制星形膠質細胞GLT-1，導致氧化應激減弱和神經元存活[14]。通過抑制谷氨酸受體2(glutamate receptor 2，GluR2)和天冬氨酸(N Methyl D Aspartate，NMDA)亞基NR2B的水平，miR-223的過度表達，減弱了海馬神經元中NMDA誘導的鈣內流，并且保護缺血性腦免受興奮性中毒神經元細胞死亡[15]。據報道，NR2A是miR-125b的靶標，miR-125b負向調節NR2A的表達[16]。被NR2B激活的NMDA受體導致興奮性中毒和細胞凋亡，而含有NR2A的NMDA受體的激活，會發揮神經保護作用，并促進神經元對抗興奮性毒性介導的神經元損傷。受NMDA受體亞單位影響的突觸可塑性發生改變，這是一種破壞性的影響，中風損傷后可塑性能促進成體腦復蘇[17, 18]。

2.2 microRNA與缺血性氧化應激氧化應激是由體內的活性氧/氮物質增加，以及抗氧化應激防御系統的減少引起的。缺血期間腦內會產生大量活性氧和自由基，形成的原因主要有興奮性毒性谷氨酸的高刺激、鈣超載、線粒體功能障礙、神經元一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)的激活，以及炎癥細胞的遷移產生的過氧化物陰離子。氧化損傷是缺血性中風期間腦損傷和神經元細胞死亡的基本機制。由于高氧環境，大量過氧化脂質和低抗氧化劑的產生，大腦最終受到進一步損傷。

核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)/血紅素加氧酶-1(haem oxygenase 1，HO-1)通路是抵抗局部缺血/再灌注引起的氧化應激的重要細胞防御機制。已有的研究顯示，miRNA參與Nrf2水平的轉錄后調節。研究表明，miR-424降低了丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平、ROS，消除了H2O2誘導的神經元損傷，從而起到神經保護作用，以抵抗缺血性氧化損傷[19]。評估miR-93在腦缺血損傷中的作用表明，miR-93直接與Nrf2基因預測的3′-UTR靶位點結合，然后減弱Nrf2和HO-1的表達[20]，另外Nrf2的增加導致SOD上調[21]。在腦缺血期間，環氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)可以產生ROS，COX-2是miR-101的靶標基因[16]。在正常情況下，COX-2低表達，而研究表明，腦缺血易于誘導神經元細胞中的COX-2高表達[22]，而腦缺血中miR-101表達下調。此外，還發現miR-146a抑制COX-2在神經系統疾病中的表達[23]。因此，miRNA可被認為是拮抗缺血性中風氧化應激的有價值的治療手段。

缺血性卒中后，miRNA功能的失調、改變，對參與缺血過程的下游靶基因有深遠的影響。單個miRNA主要通過抑制和激活許多下游mRNA靶點，來發揮其細胞功能。miRNA表達的變化與缺血后致病過程，如興奮性中毒、炎癥、氧化應激和細胞凋亡之間，都有緊密的聯系。miRNA譜提供的證據表明，它們的改變可能有益于缺血性卒中診斷，并且是潛在的治療靶點。此外，miRNAs調節眾多靶基因的能力清楚地表明它們在缺血性中風治療中的重要性。

3 缺血性中風與炎癥的關系

炎癥和免疫反應已經成為卒中發病和發展的重要因素。中風過程中的免疫炎癥反應開始于腦及其血管內。腦缺血或直接、間接的腦出血，迅速誘發原發性不可逆組織損傷。輔助過程，如興奮性毒性、氧化應激和線粒體紊亂，將這種損傷擴大到部分保留的梗死周圍區域(半暗區)。對這些事件做出反應的第一批免疫細胞似乎是腦內固有的小膠質細胞，隨后是從外周通過血腦屏障的內皮細胞管壁進入大腦的白細胞[24]。這些白細胞的進入可能是由來自垂死神經元的趨化因子引導的。內源性損傷相關分子模式分子也從死亡細胞釋放，并且有利于炎性介質的上調[25]。中樞神經系統具有豐富的神經上皮來源的常駐細胞，這些細胞被歸類為神經膠質細胞。神經膠質細胞亞型包括星形膠質細胞、少突膠質細胞和多形核細胞。最近的研究表明，神經膠質細胞不是簡單的被動支持細胞，相反，它們積極與神經元和類似缺血性腦卒中應激條件下其他CNS細胞相互作用[26]。星形膠質細胞是“神經血管單元”的基本要素，神經血管單元主要包含內皮細胞、神經元、星形細胞終末足細胞，甚至周細胞。在CNS中最多類型的神經膠質細胞是星形膠質細胞，其存在于白質(例如胼體)和灰質(例如皮質)，并且表征為先天性免疫神經膠質細胞。星形膠質細胞作為先天性神經免疫的哨兵，參與調節突觸活動，調節體內水平衡以及清除有毒代謝物[27]。中樞神經系統缺血后，星形膠質細胞經過許多變化，包括快速膨脹、提高的Ca2+信號傳導、GFAP的表達(所有反應性星形膠質細胞增生的標志)增加[28]。延長激活后，反應性星形膠質細胞將形成神經膠質瘢痕。除了這些形態改變，星形膠質細胞積極地通過產生炎癥介質(IL-6、IL-1β)、補體成分和趨化因子(CXCL12、CXCL1、CXCL10、MCP-1)，延續CNS缺血性免疫應答[29]。

因此，缺血后炎癥的發生，在腦缺血損傷的各個階段中起重要作用。在缺血性中風治療中使用抗炎策略具有一定的前景，并且由于星形膠質細胞是CNS中最豐富的細胞亞型，它們在結構和功能上，參與正常腦生理學和缺血性病理學反應。它們積極與所有類型的腦細胞進行接觸和交流。因此，星形膠質細胞在腦功能和生理學中起著重要的支持和調節作用。中風后，星形膠質細胞炎癥反應可能加劇急性期的缺血性損害，而梗死周圍區域的膠質瘢痕可能阻礙軸突再生，并隨后減少急性期后的功能結局。

4 展望

對于缺血性中風的研究，仍然有必要從多角度、多靶點尋找治療手段。一方面，缺血性中風主要是一種簡單且明確的病理狀態，伴隨著血流中斷和依賴組織的連續損傷；另一方面，缺血性卒中是一種非常復雜和異質性的疾病，其在臨床表現上除了神經系統定位癥狀和體征外，還伴有一系列的神經心理癥狀和精神行為異常。嚴格地說，中風不是單一的神經系統疾病，而是潛在的系統性問題的表現，如動脈粥樣硬化、炎癥或感染，這可能在其他器官中引起梗死，例如心臟病的發作。因此，任何針對單一環節的治療都不足以應對這一系列的問題。復方中藥已在中國和一些亞洲國家應用了幾千年，過去幾十年的研究揭示了復方中藥治療復雜疾病的優勢[30]，其含有多種具有潛在功能的生物活性成分，包括調節能量代謝、抗氧化、抑制炎癥因子釋放、抗血小板聚集等，并對血栓形成、白蛋白滲漏和肥大細胞的脫顆粒等都具有一定的抑制作用。未來探索復方中藥治療缺血性中風，必然顯現出多靶點、多途徑的治療優勢。