光遺傳學技術應用于動物行為學研究的新進展

葛會香，高 云

(南昌大學基礎醫學院生理學教研室，江西 南昌 330006)

光遺傳學技術是以病毒為載體，以分子生物學、病毒生物學為手段，將合適的外源光敏感蛋白靶向導入特定活細胞中，用不同波長及強度的光源刺激光敏感蛋白，調控神經元的活性，進而控制細胞乃至動物行為的開關。與傳統的電生理刺激和藥理學刺激相比，光遺傳學技術特異性更強，靈敏性更好，具有低毒性、快速精確、高度可逆等特點，其高時空分辨率幾乎和在體神經細胞活動過程一樣，可達到亞毫秒和毫秒級。2005年，標志著光遺傳學技術發展的一篇論文出現在人們視野起，經歷了從不被認可，到2010年，該技術入選Nature Methods 年度方法(Method of the Year)”，Science雜志“十年突破(Breakthroughs of the Decade)”[1]，再到現在，光遺傳學技術已被廣泛應用于分子生物學、臨床醫學、神經科學等眾多領域。動物行為學是研究動物各種行為的功能、機制、發展和進化的一門學科, 對神經科學的發展發揮了重要作用。光遺傳學技術極大推動了神經科學的發展，也極大地彌補了電生理無法識別特定神經元的缺點，成為在多領域、多學科被廣泛應用的一項新技術，同時也被廣泛應用于動物行為學研究。本文將就光遺傳學的具體過程及特點，以及其在動物行為學研究中的應用做一簡要綜述。

1 光遺傳學步驟

1.1尋找合適的視蛋白光敏感蛋白主要存在于單細胞微生物中，是一類可以感受不同波長光照刺激，并對該刺激產生一系列效應的膜蛋白，也稱為視蛋白。在光遺傳學研究中，充當報告基因的視蛋白通常是G蛋白偶聯受體、離子通道及離子泵。早在2005 年，Boyden等[2]證明了來自綠藻的光敏感蛋白可以使細胞產生對光的應答，這一發現使光遺傳學首次受到人們的廣泛關注。光敏蛋白是光遺傳學的一個重要元件，尋找合適的光敏感蛋白也是在應用光遺傳學技術時的一個首要步驟。

根據其組成成分，光敏感蛋白可以分為單成分視蛋白即Ⅰ型光敏感蛋白和多成分視蛋白即Ⅱ型光敏感蛋白。Ⅰ型光敏感蛋白主要來源于原核和真核微生物有機體中，主要包括細菌視紫紅質(bacteriorhodopsin，BR)、鹽視紫紅質(halorhodopsin，HR)、通道視紫紅質(channelrhodopsin，ChR)。Ⅰ型光敏感蛋白為單成分視蛋白，即感受光刺激與傳導離子是由同一分子完成，屬于G蛋白偶聯的7個α螺旋跨膜受體蛋白家族。Ⅱ型光敏感蛋白為多成分視蛋白，其蛋白分子共價鍵連接視黃醛，且要偶聯到一個轉導蛋白上，是一種視紫紅質G蛋白偶聯受體的嵌合體。

根據其功能，光敏感蛋白可分為興奮性光敏蛋白和抑制性光敏蛋白兩類，目前常用的興奮性光敏感蛋白和抑制性光敏感蛋白分別是ChR和HR兩類，其中興奮性光敏蛋白ChR在藍光照射下可使陽離子通透，從而引起神經元細胞膜發生去極化，產生相應動作電位。而抑制性光敏蛋白HR為氯離子泵，在黃光照射后可使大量氯離子內流，引起神經元細胞膜發生超極化，進而抑制神經元活性。目前，除了傳統的光敏感蛋白，許多新型光敏感蛋白也已被開發出來，如光活化的腺苷酸環化酶，這些新型光敏感蛋白也促進了光遺傳學技術的發展[3]。

近年來，有研究者發現了兩種新的通道視紫紅質Chronos和Chrimson[4]。Chronos是一種超敏感的藍色通道視紫紅質，其動力學比傳統的視紫紅質更快；Chrimson是一種紅光驅動通道視紫紅質，與之前的任何通道視紫紅質相比,其都紅移45 nm。Chrimson和Chronos是較新穎的分子，代表了視蛋白工程領域的飛躍，它們的光譜和較快的動力學使新型的光遺傳學實驗成為了可能。近期有文獻表明，Chloromonas oogama ChR(CoChR)是一種功能強大的光敏蛋白，也可能是迄今為止描述的最大光電流視蛋白[5]。

1.2向受體細胞輸送光敏感蛋白選擇好合適的視蛋白后，光遺傳學技術的第二步就是向受體活細胞中輸送視蛋白，即光敏感蛋白基因的轉染及表達。通常通過病毒轉導、轉染、cre-依賴的表達體系或構建轉基因動物等方式，將體外合適的視蛋白基因靶向導入到受體活細胞中。通過病毒轉導的方式輸送光敏感蛋白，是目前光遺傳研究中最常用的一種方式，即以病毒為載體，將外源光敏感蛋白通過載體病毒靶向導入到特定受體活細胞中。

慢病毒(lentivirus,LV)、逆轉錄病毒(retrovirus,RV)、腺相關病毒(adenovirus associated virus,AAV)、狂犬病病毒(rabies virus,RV)、單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)是目前常用的病毒感染載體[6]。LV為RNA病毒的一種，可以攜帶外源目的基因，并可將其整合到宿主細胞的染色體上，從而達到目的序列持久表達的效果，此類病毒載體可以感染分裂和非分裂細胞。逆轉錄病毒多具有逆轉錄酶，也為RNA病毒的一種，此類病毒可以克隆外源基因并將其表達，但由于缺失病毒包裝基因，而不能進行自我包裝成為有增殖能力的病毒，并且此類病毒只能感染分裂期細胞。AAV通常需要腺病毒協助復制，為雙鏈DNA病毒的一種，可感染多種細胞。而重組腺相關病毒載體(recombinant adeno-associated virus，rAAV)的AAV編碼基因一般被外源基因表達元件所替換，僅保留了病毒復制和包裝所需序列。雖然幾種病毒載體目前都較為常用，但LV載體具有潛在的生物學危險，逆轉錄病毒載體感染細胞類型單一且容量有限，而AAV載體因具有更低的生物學危險及組織感染的相對特異性，并且無致病性，因此AAV載體在光遺傳研究中更具吸引力。此外，狂犬病病毒、HSV-1和VSV因其容量大、標記效率高等優點，也已被廣泛應用到光遺傳研究中。

1.3光源的選擇合適的外源光敏感蛋白通過病毒載體被靶向導入到受體細胞，經過10～14 d時間被充分表達后[7]，則需要用不同參數的光照進行調控，通過不斷改變光照的波長及光脈沖強度，來精準調控細胞、組織乃至器官的相應生物學反應。

光遺傳學技術的光照有體外研究的光源和體內光照射兩種。體外研究的光源包括發光二極管和激光。發光二級管(light-emitting diode，LED)是由含磷(P)、砷(As)、氮(N)、鎵(Ga)等的化合物組成的一種半導體電子元件，這種電子元件能將電信號轉化為光信號[8]。在發光二極管的基礎上，新一代顯示技術的微發光二極管(μ-ILED)因其更加的微小化，而在光遺傳學技術中備受關注[9]。但由于LED光譜較寬，光照較弱，而激光在受激輻射狀態下可以產生放大的光，并且具有發散度小、單色性好、亮度極高等特點，因此光纖激光目前在光遺傳學技術應用中一直備受重視。但這兩種光源都為可視光，可視光在經過組織時會發生不同程度散射，光線衰減，光束的形態也會發生改變[8]。而體內光照射的植入式激光耦合光纖，可將光刺激更加有效地傳遞到體內深部組織中[10]，因此，體內植入光纖進行體內光照射的方式相比體外光照方式更受重視。目前，微型LED陣列的體內植入更是將大型光纖植入所產生的侵入性降到了最低[11]。在神經回路的功能研究中，經常需要同時記錄多個大腦區域活動，因此，可以實現多個通道同時記錄的多通道光纖記錄系統就是一種非常有用和必要的研究方法[12]。

1.4觀察光刺激后的動物行為并記錄信號光遺傳學技術的最后一步即觀察光照刺激對細胞、組織、器官，甚至整個動物的影響，并記錄信號，最后進行效應評估。在不同程度光照刺激后，結合計算機程序，使用與之匹配的解讀方法，進行信號記錄。與光調控相匹配的解讀方法主要包括：腦片電生理-全細胞膜片鉗技術可對電生理信號進行解讀；功能性核磁共振成像可對神經元活動所引起的血液動力改變進行解讀；功能性光學成像技術包括鈣離子成像技術和電壓成像技術，可對鈣離子濃度或電壓信號變化進行動態記錄等[13]。例如，在體實驗中，經過在體光照刺激后，光敏感蛋白通道激活，細胞膜內外形成離子差，膜電位發生改變，可根據解讀體系記錄神經元的放電情況[14]。近年來，雙光子光遺傳學備受關注，有研究者結合雙光子計算機生成全息技術(computer generated holography, CGH)和新型光敏蛋白體細胞CoChR(somatic CoChR, soCoChR),成功將光遺傳學技術的精確度提高到了1 ms內,同時也實現了對單個神經元的光敏操作[5]。

2 光遺傳學技術在動物行為學研究中的應用

光遺傳學技術最初起源于神經科學領域，自發展之初至今十余年來，光遺傳學技術在神經科學領域發生了迅猛發展，并得到了廣泛應用，進而擴展到動物行為學研究中。因光遺傳學技術具有快速精準、高度特異等優點，從而為探究特定類型神經元活動與動物行為改變之間的關系提供了可能[7]。

2.1光遺傳學技術在動物進食行為方面的研究應用光遺傳學技術在動物進食行為方面有很好的應用前景，此方法可通過對動物大腦特定神經元活動的調控，來實現對動物進食行為的研究。Heydendael等[15]研究表明，下丘腦神經肽/下丘腦分泌素可以調節神經內分泌對壓力的行為反應，并通過光遺傳學技術闡明了下丘腦分泌素/進食素在特定情境中的交互作用。近期，美國耶魯大學醫學院的研究人員在小鼠大腦中發現了一群特異性神經元，當其被激活時會引發小鼠暴食樣進食行為，該研究表明，大腦未定帶中的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid, GABA)能神經元在被光探針激活時，可誘導小鼠重復性進食[16]。

2.2光遺傳學技術在動物獎賞行為方面的研究應用在研究光照刺激與小鼠行為之間的關系上，光遺傳學方法利用光照刺激，并結合給與獎勵的行為學訓練方式，將興奮性光敏蛋白ChR-2表達在小鼠桶狀皮層神經元中，來證實小鼠獎勵行為與光照刺激具有相關性，研究表明兩者具有較強相關性[17]。多巴胺(dopamine, DA)能神經元在動物獎賞行為方面起著核心作用，中腦多巴胺獎賞系統由伏隔核(nucleus accumbens, NAc)及中腦腹側被蓋區(ventral tegmental area ,VTA)等多個核團組成。近期有研究人員利用光遺傳學和行為學方法，觀察到NAc內側殼神經元可通過激活不同GABA受體類別來控制中腦邊緣DA能神經元亞群，而NAc外側殼神經元主要投射在VTA區GABA能神經元上，可導致投射回NAc外側殼的DA神經元去抑制，進而調節激勵行為[18]。

2.3光遺傳學技術在動物抑郁焦慮行為方面的研究應用隨著生活節奏的不斷加快，生活壓力也隨之增大，而抑郁癥的發病率更是呈不斷上升趨勢，其臨床特征主要表現為持久的食欲改變、喪失興趣、缺乏快感、精神低落等[19]。有研究表明，50%的抑郁癥患者無法得到完全治愈，因此隨著時間的推移，許多患者出現了治療耐藥性的情況[20]。研究表明，抑郁行為與大腦中獎賞神經環路被破壞有關[21]，而光遺傳學技術具有精準定位神經元的優勢，因此為抑郁癥的治療提供了新的方法。斯坦福大學Chaudhury等[22]利用光遺傳學技術的時間精準性、高度特異性等特點，證明了光照刺激相應神經元可使正常小鼠對社交失敗壓力更加敏感，同時也證明了中腦多巴胺神經元的活性可通過不同的光照刺激被精確調控，進而快速調節抑郁癥相關行為。

2.4光遺傳學技術在動物痛行為方面的研究應用疼痛是由有害或潛在破壞性刺激引起的主觀不愉快的一種感覺或情緒體驗[23]。在疼痛研究中，光遺傳學方法第一次被應用是Daou等[23]通過藍光刺激Nav 1.8-ChR2+轉基因小鼠,實驗中小鼠表現出強烈的傷害性反射行為，表明哺乳動物中的疼痛是可以被光誘導的，此結果將有助于疼痛藥物的開發和疼痛的治療等。Fran?ois等[24]使用體內光遺傳學及化學遺傳學技術，操縱和基因識別脊髓背角及延腦頭端腹內側區(rostral ventromedial medulla, RVM)神經元的跨突觸追蹤顯示，RVM脊髓初級傳入通路控制疼痛閾值，結果表明RVM GABA能神經元通過抑制脊髓背角腦啡肽/GABA能中間神經元，可促進機械性疼痛。近期有研究表明，可將光敏感蛋白表達在單個背根神經節(dorsal root ganglia，DRG)上，然后在清醒小鼠單個DRG的臨近位置植入微發光二極管，單個DRG內目標特異性感覺神經元群體的活動即可通過不同光照刺激來進行調節，此研究為光遺傳學技術控制內臟感覺提供了強有力的證據[25]。

3 展望

光遺傳學技術雖然在動物行為學研究中被廣泛應用，并不斷發展與創新，但目前仍存在很多問題。這些問題主要包括：病毒載體毒性、特異性及其表達的穩定性；探針的靈敏度、時間分辨率及長期穩定性；基因表達對神經回路的干擾；光刺激和讀取時硬件上的限制等。盡管在動物行為學研究中，光遺傳學技術相比之前傳統的技術具有很好的優勢，但人們在更廣泛的應用此技術時，它的局限性也正逐漸被人們所知。因此，光遺傳學技術在動物行為學研究中，仍需要不斷地改變與創新，這將有賴于技術的不斷革新，方法的不斷優化，包括尋找或改造得到更加有效的光敏蛋白、低毒穩定的病毒載體、更加有效的光源、更加精確的計算機解讀軟件程序、分辨率更高的熒光顯微鏡等，使它們能更好地適用于研究需要。雖然光遺傳學技術仍存在許多問題需要解決，但其在動物疼痛行為、焦慮行為及抑郁行為等研究中都有較好的應用前景，隨著此項技術在不同領域研究的不斷深入，這些問題都將會一一得到解決。相信在不久的將來, 光遺傳學技術在行為學研究及其他各個領域都會有更加廣泛的應用。