華蟾酥毒基通過FAK/PI3K/Akt通路抑制食管癌Kyse-520細胞遷移和侵襲

盛杰霞，鄧 旭，包 軍，王志美，代二慶，鄧全軍

(1. 錦州醫科大學中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院研究生培養基地，天津 300162；中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院2. 軍人醫療保健中心、3. 消化內科，天津 300162)

食管癌是中國主要的公共衛生問題，是全球第八大常見癌癥，也是癌癥死亡的第六大常見原因[1]，具有起病隱匿、進展迅速、治愈率差等特點[2]。早期手術切除是食管癌主要的治療手段，大部分患者確診時已進展至晚期，經常伴隨全身多處轉移，已錯失最佳手術機會，因此，尋找有效防治食管癌侵襲和轉移的藥物刻不容緩。近年來，研究發現，許多傳統中藥的有效成分均有明顯的抗腫瘤活性。中藥蟾酥是中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍耳后及皮膚分泌物經加工干燥而成，具有止痛、強心、抗菌、局部麻醉和抗腫瘤作用。華蟾酥毒基是來自蟾蜍皮膚的主要活性化合物，現有數據表明，華蟾酥毒基具有抗乳腺癌、肺癌、胰腺癌、結腸癌和肝癌的抗腫瘤活性[3-4]，但是它在食管癌中的抗腫瘤機制少見報道。PI3K/Akt信號通路失衡是介導食管癌細胞發生侵襲遷移的重要分子機制[5]，通過激活Akt調節下游信號分子，影響腫瘤細胞運動性和血管生成，局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)在這一過程中起調控作用[6]。因此，本研究以人食管鱗癌細胞株Kyse-520為研究對象，觀察華蟾酥毒基對食管癌細胞體外增殖、侵襲和轉移的影響，并探討其作用機制是否與FAK/PI3K/Akt通路有關。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞與試劑 人食管鱗癌細胞株Kyse-520購自中國科學院細胞庫。華蟾酥毒基(批號3070，質量分數 ≥ 98%)購自上海詩丹得生物技術有限公司；CCK-8試劑盒(上海東仁化學科技有限公司)；逆轉錄試劑盒、SYBR Mixture(康為世紀生物科技有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、RPMI 1640培養基(美國Gibco)；Matrigel膠、Transwell小室(Corning公司)；總RNA提取試劑RNAiso Plus(北京寶日醫生物技術有限公司)；ECL化學發光試劑(美國伯樂公司)；BCA蛋白定量試劑盒(索萊寶生物技術有限公司)；FAK、PTEN兔抗人多克隆抗體、β-actin鼠抗人單克隆抗體、HRP標記的二抗(美國Proteintech公司)；p-FAK(Tyr397)、Akt、p-Akt(Ser473)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9, MMP-9)、MMP-2兔抗人單克隆抗體(Abcam公司)。

1.1.2儀器 JuLITMStage實時細胞記錄儀(韓國NanoEnTek公司)；超微量分光光度計NP80(德國IMPLEN公司)；PCR TCR0096(美國Thermo公司)；M2型全波長酶標儀(美國MD公司)；Power Pac Basic電泳儀、ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(美國伯樂公司)。

1.2方法

1.2.1CCK-8法檢測細胞增殖活性 Kyse-520細胞按常規方法消化傳代，并置于37 ℃、含5% CO2的培養箱中孵育。經預實驗證實，含0.1%溶媒(DMSO)的培養液對細胞生長無明顯影響。在96孔培養板中，每孔接種對數生長期的細胞懸液100 μL，設立對照組、藥物組和僅含培養基的空白組，每組設5個復孔并孵育過夜。然后，空白組和對照組每孔補充新鮮的完全培養基100 μL，藥物組每孔加入100 μL含有不同濃度華蟾酥毒基(0.025、0.1、0.4、1.6、6.4 μmol·L-1)的培養基，置于培養箱中分別孵育12、24、48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h后，酶標儀測定450 nm處吸光度(A)值。按照公式計算細胞增殖率，細胞增殖率=(A藥物組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。利用直線回歸方程計算華蟾酥毒基不同作用時間的半數抑制濃度(IC50)值。實驗獨立重復3次。

1.2.2劃痕愈合實驗檢測細胞運動性 Kyse-520細胞分別設立對照組和華蟾酥毒基(25、50、100 μmol·L-1)組，將密度為1×105·L-1的細胞均勻鋪于6孔板中，培養箱中孵育16～24 h使其形成單層細胞。含1% FBS的培養基饑餓12 h后，用10 μL槍頭在單層細胞中間劃3條平行直線。PBS洗凈劃傷細胞，按實驗分組加入含不同藥物濃度的完全培養基，每孔選取5個固定位點進行實時監測，實時細胞記錄儀置于含5% CO2的37 ℃培養箱中，設置6 h為1個循環，監測9個循環后，利用JuLITMStage系統軟件進行開放傷口面積測量和百分比計算[7]。

1.2.3Transwell小室法檢測細胞侵襲遷移能力 對數生長期的Kyse-520細胞，用含1% FBS的培養基饑餓12 h，然后加入含有不同濃度華蟾酥毒基(0、25、50、100 nmol·L-1)的完全培養基干預24 h。在Transwell遷移實驗中，將孔徑為8.0 μm的Transwell小室置于24孔板中。常規消化各組細胞，用無血清培養基制備細胞懸浮液，并以5×104/孔的細胞密度接種在Transwell上室中，同時在下室中加入600 μL含15% FBS的完全培養基。37 ℃培養24 h后，用鑷子取出Transwell小室，PBS洗滌3次，100%甲醇室溫固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，然后用濕棉簽擦去濾膜上表面的未遷移細胞。在顯微鏡下，隨機選取5個視野計數，計算遷移細胞數目的平均值，并進行統計學分析。

在侵襲實驗中，Transwell小室上底面需要均勻涂覆60 μL用無血清RPMI 1640培養基1 ∶4稀釋后的基質膠，置于培養箱中凝固1 h。其余步驟與Transwell遷移實驗一致。所有實驗獨立重復3次。

1.2.4RT-qPCR檢測基因mRNA表達水平 將Kyse-520細胞以5×105·L-1密度接種在6孔培養皿中，培養箱中繼續孵育24 h。然后分別加入2 mL含有不同濃度華蟾酥毒基(0、25、50、100 nmol·L-1)的完全培養基干預24 h。收集各組細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，應用超微量分光光度計NP80測定RNA純度及濃度[8]。引物由上海生工生物工程有限公司設計合成(Tab 1)。按實驗說明書進行cDNA合成，采用20 μL體系進行PCR擴增：2 μL cDNA，10 μL 2×UltraSYBR Mixture，6.8 μL RNase ddH2O和0.6 μL兩種特異性引物(10 μmol·L-1)；反應條件：95 ℃ 10 min預變性，95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min，進行40個PCR循環。反應結束時進行熔解曲線分析，以評估擴增的特異性。每個cDNA樣本設置3個復孔，實驗結果采用2-ΔΔCt進行相對定量，與對照組相比的倍數變化作為mRNA相對表達量。所有實驗獨立重復3次。

Tab 1 Primers used for RT-qPCR

1.2.5Western blot檢測蛋白表達水平 融合度達80%的Kyse-520細胞用含不同濃度華蟾酥毒基(0、25、50、100 nmol·L-1)的完全培養基干預24 h。加入200 μL RIPA裂解液與1×酶抑制劑的混合液，冰上裂解30 min后，收集上清液。BCA法測定蛋白濃度，40 μg總蛋白加入12% SDS-PAGE凝膠中電泳分離。采用半干轉膜法將蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉或5% BSA室溫封閉1 h，分別加入1 ∶1 000～1 ∶2 000稀釋的FAK、p-FAK，Akt、p-Akt、PTEN、VEGF-A、MMP-2、MMP-9和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次后，加入相應HRP標記的二抗(1 ∶10 000稀釋)，室溫孵育1 h。在成像系統上化學發光并對條帶進行灰度值分析，β-actin作為內參，目的蛋白與內參灰度值的比值作為蛋白相對表達量。所有實驗獨立重復3次。

2 結果

2.1華蟾酥毒基抑制食管癌Kyse-520細胞增殖活性Fig 1的CCK-8結果顯示，華蟾酥毒基以時間和濃度依賴的方式抑制食管癌細胞的增殖(P<0.05)，其作用Kyse-520細胞12、24、48 h的IC50值分別是6.002、0.625、0.079 μmol·L-1。同時發現，同一作用時間下，華蟾酥毒基濃度低于0.1 μmol·L-1時細胞增殖活性下降較少，因此，選取25、50、100 nmol·L-1的華蟾酥毒基進行后續實驗，以探討其對Kyse-520細胞侵襲遷移能力的影響[9]。

2.2華蟾酥毒基抑制食管癌Kyse-520細胞的遷移癌細胞的遷移能力與腫瘤的侵襲和轉移呈正相關[9]。劃痕愈合實驗結果表明(Tab 2、Fig 2)，無論是6 h，還是48 h，各濃度華蟾酥毒基均能明顯縮小劃痕愈合面積(P<0.01)，且隨著時間的延長和藥物濃度的增加，“傷口”逐漸增大，提示華蟾酥毒基抑制食管癌細胞的“二維”平面遷移，且該效應呈濃度和時間依賴性。不同濃度華蟾酥毒基干預24 h后，Transwell遷移實驗結果顯示(Fig 3)，隨著藥物濃度的增加，Kyse-520細胞穿膜細胞數明顯減少(P<0.01)，提示華蟾酥毒基可明顯抑制食管癌細胞的“三維”平面遷移，且存在明顯的量效關系。

Fig 1 Effect of cinobufagin onproliferation of Kyse-520

*P<0.05vs12 h group at same concentration;#P<0.05vs24 h group at same concentration

2.3華蟾酥毒基抑制食管癌Kyse-520細胞的侵襲Matrigel基質膠可以一定程度上模擬癌細胞在體內侵襲環境中的細胞外基質[10]，Transwell侵襲實驗可以用來評估華蟾酥毒基對Kyse-520細胞侵襲能力的影響。Fig 3結果顯示，與對照組相比，經25、50、100 nmol·L-1的華蟾酥毒基處理24 h后，Kyse-520的穿膜細胞數明顯減少(P<0.05，P<0.01)，且呈濃度依賴的方式，提示華蟾酥毒基可明顯抑制食管癌細胞的侵襲能力。

2.4華蟾酥毒基對食管癌Kyse-520細胞中FAK/PI3K/Akt信號通路和侵襲轉移相關蛋白mRNA表達的影響Tab 3的RT-qPCR結果顯示，當華蟾酥毒基的濃度為50、100 nmol·L-1時，VEGF-A、MMP-2、MMP-9 mRNA表達明顯下調，PTEN mRNA表達明顯上調，與對照組相比差異有顯著性(P<0.01)，且呈一定的濃度依賴性，而FAK、Akt mRNA表達改變不明顯。

Tab 2 Effect of cinobufagin on migration of Kyse-520 cells detected by wound healing

**P<0.01vscontrol group at the same time

Fig 2 Effect of cinobufagin on migration of Kyse-520 cells(×40)

Fig3EffectofcinobufaginoninvasionandmigrationofKyse-520cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Tab 3 Effect of cinobufagin on mRNA expression levels of FAK, Akt, PTEN, MMP-2, MMP-9 and VEGF-A in Kyse-520

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 4 Effect of cinobufagin on expression levels of relative proteins in Kyse-520 vs control group

2.5華蟾酥毒基對食管癌Kyse-520細胞中FAK/PI3K/Akt信號通路和侵襲轉移相關蛋白表達的影響如Fig 4所示，當華蟾酥毒基的濃度為50、100 nmol·L-1時，與對照組相比，VEGF-A、MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯減少(P<0.05，P<0.01)，PTEN蛋白表達明顯上升(P<0.05)，FAK和Akt總蛋白表達無明顯變化。由于FAK/PI3K/Akt信號通路主要是通過磷酸化發揮作用[6]，因此，Western blot檢測了p-FAK(Tyr397)、p-Akt(Ser473)的表達，發現隨著藥物濃度的增加，二者磷酸化水平均明顯下調(P<0.05，P<0.01)，提示華蟾酥毒基可明顯抑制FAK/PI3K/Akt信號通路。

3 討論

食管癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，進展迅速，并且經常伴隨淋巴結和遠端器官的轉移。侵襲和轉移是癌細胞最具代表性的生物學特性，它的發生包括多個復雜的過程，涉及眾多信號通路，并且受到轉錄因子、生長因子、微環境等影響[11]。靶向抑制誘導癌細胞侵襲轉移的信號途徑作為治療腫瘤的一個新的策略已被廣大學者認同，這也可能是很多天然藥物阻止或切斷食管癌轉移進程的作用機制。臨床資料顯示，華蟾酥注射液、片劑、膠囊等制劑針對惡性腫瘤的治療取得很好療效。大量實驗室研究表明，其主要活性成分華蟾酥毒基的抗腫瘤機制可總結為抑制細胞增殖，誘導分化，促進凋亡，引起周期阻滯，抑制腫瘤血管生成，逆轉多藥耐藥和調節免疫反應等[12]。同時體內外實驗表明，華蟾酥毒基可以抑制結腸癌、骨肉瘤等惡性腫瘤的侵襲轉移[3,13]。本研究也發現，華蟾酥毒基體外可明顯抑制人食管癌Kyse-520細胞的增殖，即使是對細胞增殖活性影響較弱的濃度也可明顯縮小劃痕愈合面積，減少遷移和侵襲穿膜細胞數，提示其對食管癌細胞的遷移和轉移具有明顯抑制作用。

大量研究已經證實，抑制PI3K/Akt通路可以降低腫瘤細胞的侵襲遷移能力[14]。PI3K是由110 ku催化亞基和85 ku調節亞基組成的異二聚體酶，活化的PI3K磷酸化PIP2以產生PIP3，隨后，PIP3積累并將Akt/PKB和PDK1募集到細胞膜上，被激活的Akt會使大量下游底物磷酸化，進而調控細胞遷移、周期進程、存活和代謝[15]。FAK是一種細胞質酪氨酸激酶，高水平的FAK誘導轉移，并且與食管癌的不良預后相關。本研究采用RT-qPCR和Western blot檢測華蟾酥毒基處理的Kyse-520細胞中FAK和Akt的表達水平，結果顯示，FAK和Akt總蛋白及mRNA表達無明顯變化，進一步檢測其磷酸化水平，發現華蟾酥毒基可明顯下調p-FAK(Tyr397)和p-Akt(Ser473)。眾所周知，基質金屬蛋白酶可以降解基底膜和細胞外基質，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉移中起關鍵性作用，MMP-2和MMP-9是其中最重要的一類。VEGF家族直接或間接地與腫瘤轉移有關，而VEGF-A可以激活靜息血管內皮細胞，誘發血管生成并促進腫瘤細胞遷移。有研究證實，FAK通過激活PI3K/Akt通路，調節VEGF-A、MMP-2和MMP-9的活性，促進血管生成、細胞遷移和侵襲[8]。本研究也發現，華蟾酥毒基濃度依賴性地降低VEGF-A、MMP-2和MMP-9的轉錄和翻譯水平。上述結果提示，華蟾酥毒基通過FAK/PI3K/Akt信號通路，下調VEGF-A、MMP-2和MMP-9的表達，進而抑制食管癌的遷移和侵襲。

PTEN是一種雙重脂質蛋白磷酸酶，是FAK/PI3K/Akt信號通路負調控因子。正常情況下，PTEN與PI3K的功能相反，可以通過去磷酸化將PIP3轉變為PIP2；同時，PTEN還具有特異性蛋白磷酸酶功能，通過下調FAK酪氨酸磷酸化，抑制整合素介導的細胞浸潤、轉移及生長，進而抑制癌細胞遷移擴散和黏附[10]。在鼠胚胎干細胞或人癌細胞系中，PTEN功能的喪失導致PIP3的積累，模擬PI3K激活的作用，并激活其下游效應物PDK1、Akt和Rac1/CDC42[15]。本研究也顯示，華蟾酥毒基在削弱FAK磷酸化和抑制PI3K/Akt活化的同時，明顯增加Kyse-520細胞中PTEN的表達。

綜上所述，華蟾酥毒基通過誘導PTEN表達，負調控FAK/PI3K/Akt途徑，下調VEGF-A、MMP-2和MMP-9的表達，進而抑制食管癌細胞的遷移和侵襲。

(致謝：本實驗在武警后勤學院附屬醫院救援醫學研究所完成，感謝課題組老師同學們的協助。)