槲皮素通過調控PI3K/Akt信號通路對血管內皮祖細胞發(fā)揮保護作用

孫 軍，溫昌明，張保朝，暴向陽

(1. 南陽市中心醫(yī)院神經內科，河南 南陽 473000；2. 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院神經內科，北京 100850)

血管內皮細胞的前體細胞既稱為成血管細胞，也稱為內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，這類細胞可以積極參與到損傷血管的修復活動，其數量多少維持血管的正常活動[1]。EPCs能調控缺血性腦卒中疾病新生血管活動，保證EPCs的數量對于缺血性疾病的治療是一個新的研究方向[2]。在血管氧化應激的狀態(tài)下，外周血循環(huán)中EPCs的數量影響著損傷血管的內皮修復程度，同時，損傷時產生氧化應激反應會降低EPCs的生成。減輕氧化應激反應對EPCs損傷的影響，可有利于增加EPCs數量，促進新生血管的形成及血管內皮的修復，最終起到腦缺血部位保護修復作用[3]。PI3K/Akt信號通路能調節(jié)細胞代謝、生長、遷移、增殖等生理過程，文獻指出，EPCs分化為內皮細胞過程中，PI3K/Akt的參與能促進EPCs分化為內皮細胞，使缺血部位得到新生和修復。

槲皮素(quercetin，Que)具有擴張血管降血壓、防治冠心病、防治心肌缺血/再灌注損傷、抗血栓形成等多種功效，除此以外，Que還具有抗氧化的生物學活性，從而發(fā)揮對腦血管缺血病灶的修復和保護。研究也表明，Que能促進EPCs的增殖，但具體的機制尚未明確[4]。本文擬通過研究Que對氧化應激損傷EPCs的修復作用，探討Que調控PI3K/Akt信號通路對損傷部位的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 Que購自美國 Sigma 公司，純度大于98%，以0.2 mmol·L-1溶于DMSO中；人纖連蛋白、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF)、FITC標記的荊豆凝集素-1(FITC-UEA-1)，均購于Sigma公司；DiI標記的乙酰化低密度脂蛋白 (DiI-ac-LDL)購于Abcam公司；血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)購于Hyclone公司；胎牛血清購于Gibco公司；p-Akt、Akt、β-actin及二抗，均購自Abcam公司；WST-1檢測試劑盒購自碧云天；cDNA， InvitrogenTM合成試劑盒、SYBR Green qPCR SuperMix(Thermo公司)。

1.1.2儀器 酶標儀、凝膠成像儀、電泳儀(Bio-Rad公司)；熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；LightCycler 480 System RT-PCR(Roche公司)。

1.2EPCs的分離及培養(yǎng)取自南陽市中心醫(yī)院健康分娩新生兒的臍血(每份60 mL)，已得到新生兒母親的同意用于科學研究實驗，該實驗在南陽市中心醫(yī)院重點實驗室中進行。單個核細胞通過密度梯度離心方法進行分離，運用細胞培養(yǎng)技術接種于用人纖連蛋白包被的培養(yǎng)板上，加入一定量的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)4 d，用緩沖液洗掉非貼壁細胞，M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至d 7時，進行細胞鑒定。

1.3EPCs的鑒定EPCs在培養(yǎng)至d 7后，直接放在倒置相差顯微鏡下，觀察細胞形態(tài)特征是否符合EPCs的特點。并利用染料DiI-ac-LDL與FITC-UEA-1進行染色，熒光顯微鏡下鑒定并拍照。

1.4實驗分組及WST-1法篩選合適的Que實驗濃度分離接種后的細胞培養(yǎng)至d 7后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化貼壁細胞，將細胞密度調整至2×109·L-1，每孔吸取2 mL均勻接種于6孔板，隨機分為空白對照組(無細胞)、Que組(分別加入0、30、60、90、120 μmol·L-1Que預處理30 min，加入500 μmol·L-1H2O2再處理8 h)。每組設6個復孔，用WST-1法檢測實驗組4個濃度Que對EPCs增殖的影響，24 h后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入WST-1溶液10 μL，培養(yǎng)箱內孵育2h后把96孔板置于搖床上搖動1 min，充分混勻在450 nm處測定吸光度(A)值。細胞活力=(A加藥-A空白)/(A0加藥-A空白)×100%。

1.5EPCs不同時段增殖情況將培養(yǎng)好的EPCs以2×103個均勻接種至96孔板，待細胞完全貼壁后，用M199培養(yǎng)液(不含血清)培養(yǎng)24 h，使每孔細胞生長情況一致。按分組再加入各種干預因素，根據WST-1結果篩選出兩個濃度，Que實驗組(60、90 μmol·L-1)分別加入60、90 μmol·L-1Que預處理30 min，再加入500 μmol·L-1H2O2處理8 h，期間每隔24 h換液1次，并按分組加入干預物質。培養(yǎng)12、24、48 h后，每孔分別加入10 μL WST-1溶液孵育2 h，酶標儀波長設置為450 nm，測定OD值。每組均設6個復孔，同時進行培養(yǎng)和檢測。

1.6Westernblot檢測Akt和磷酸化Akt蛋白的表達培養(yǎng)的細胞棄培養(yǎng)液，用PBS進行沖洗，加入裂解液15 min，刮下細胞進行超聲和離心，BCA法測定蛋白濃度，調至等濃度。SDS-PAGE電泳，轉膜，而后將膜封閉1 h，加入小鼠抗人Akt、磷酸化Akt單克隆抗體(1 ∶1 000)，于4 ℃條件下輕搖過夜，d 2用TBST漂洗3次，每次10 min，加入HRP標記的二抗，室溫輕搖2 h，再用TBST漂洗3次，用化學發(fā)光法進行曝光和顯影，用Image J軟件分析蛋白相對量。

1.7qPCR檢測各組細胞PI3K、AKT3mRNA的表達用TRIzol法提取各組3個時間點的細胞總RNA，按cDNA合成試劑盒操作說明步驟進行擴增，設置反應條件：37 ℃反轉錄15 min，85 ℃ 5 s終止反應。引物序列見Tab 1，由上海生工生物公司設計合成。逆轉錄后，檢測RNA純度，并取適量逆轉錄產物按熒光定量PCR試劑盒操作說明進行擴增，設置擴增反應條件：95 ℃預變性30 s后，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s擴增40個循環(huán)。擴增結果采用ABI7500SDS 軟件中的Relative Quantification (ddCt) Study分析PI3K、AKT3 mRNA的相對表達量。

Tab 1 Prime sequence and PCR product length

2 結果

2.1EPCs的鑒定如Fig 1所示，剛分離得到的單核細胞置于倒置相差顯微鏡下觀察，細胞形態(tài)呈圓形，胞體折光性好，為光亮透明的狀態(tài)。培養(yǎng)7 d后，顯微鏡觀察細胞體積增大，大多細胞呈梭形，生長呈集落樣，并有一定的方向性，形態(tài)鑒定即為內皮祖細胞。培養(yǎng)7 d后的貼壁細胞，用Dil-ac-LDL和 FITC-UEA-1熒光染料處理后，在激光共聚焦顯微鏡下，雙染色熒光黃陽性細胞為正在分化的 EPCs。

Fig 1 DiI-ac-LDL and FITC-UEA-1

2.2Que對EPCs的影響如Fig 2所示，Que在0～90 μmol·L-1范圍內，無明顯的細胞毒性，但30 μmol·L-1Que對EPCs增殖無任何作用。根據結果，后續(xù)實驗選擇60、90 μmol·L-1Que進行干預。

Fig 2 Effect of different concentrations of Que

**P<0.01vscontrol group

2.3Que對EPCs增殖的影響如Tab 2所示，在氧化應激條件下，與空白對照組比較， H2O2組EPCs增殖能力明顯降低(P<0.01)，加入60、90 μmol·L-1的Que處理后，H2O2誘導的EPCs損傷后的細胞增殖能力有明顯改善，與H2O2組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。

Tab 2 Effects of quercetin on EPCs proliferation at different

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsH2O2

2.4Que對氧化應激時ECPs中Akt和p-Akt表達的影響Fig 3、Tab 3、Tab 4結果顯示，與對照組比較，H2O2處理后的模型組各時間點Akt及磷酸化Akt表達明顯下降。與H2O2模型組比較，加入Que 60、90 μmol·L-1從24 h開始，Akt和磷酸化Akt表達量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義。

2.5Que對EPCsPI3K、AKT3mRNA表達的影響如Tab 5、6 所示，與正常對照組相比，H2O2模型組細胞中PI3K、AKT3 mRNA 水平明顯下降；與H2O2模型組比較，Que(60、90 μmol·L-1)干預后，3個時間點的PI3K mRNA水平明顯升高；Que(60、90 μmol·L-1)干預后，3個時間點 AKT3 mRNA水平較 H2O2模型組明顯上升(P<0.01，P<0.05) 。

Fig 3 Western blot analysis of Akt and p-Akt after 24 h

Tab 3 Expression of Akt after each period

*P<0.05vscontrol;##P<0.01vsH2O2

Tab 4 Expression of p-Akt after each cell culture period

*P<0.05vscontrol;##P<0.01vsH2O2

3 討論

EPCs能分化為血管內皮細胞，其分化可以使血管重生和重新內皮化作用，其生理過程能在血管內壁修復損傷、新生血管、改善腫瘤病理等方面有多樣的應用前景。據相關文獻報道，EPCs一開始來源于骨髓，能釋放至外周血中進行生理活動，并在條件和環(huán)境的變化中分化成內皮細胞，進行血管的新生和內皮破損地方修復，在各病理和組織工程學領域均有廣泛的應用[5-6]。由于EPCs對于血管的功能的重要性，因此對作用機制及其影響因素進行探討顯得尤為重要，作為血管內皮的前體細胞能夠定位到受損的血管壁的新生內膜中，成功分化為有修復功能的內皮細胞。氧化應激反應能夠削弱EPCs的增殖、分化、黏附、遷移能力，其受損后的氧化代謝物能進一步加速EPCs的凋亡[7]。腦血管病是一種腦部動脈或支配腦的頸部動脈受損的疾病，極易導致顱內血液流動發(fā)生障礙，氧化應激過度產生的活性氧代謝物質，能造成缺血/再灌注氧化應激血管再度損傷，因此，從氧化應激角度保護EPCs是一項重要的課題[8]。H2O2能產生大量氧自由基，引起細胞內氧化應激反應，是建立細胞氧化應激反應模型常用試劑之一。本實驗證實，H2O2培養(yǎng)8 h后，EPCs的增殖能力降低且活性低，多數細胞處于凋亡狀態(tài)，證實細胞氧化應激模型的存在，在此模型上，研究Que對于氧化應激病理過程中EPCs的修復作用是如何進行的。

Tab 5 Effects of PI3K mRNA levels after cell culture

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsH2O2

Tab 6 Effects of AKT3 mRNA levels after cell culture

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsH2O2

文獻報道，EPCs分化為內皮細胞的過程可能與PI3K/Akt信號通路有關。同時有研究顯示，高密度脂蛋白可以激活PI3K/Akt信號通路，促使血管EPCs向內皮細胞分化的過程，進而誘導一氧化氮合酶生產，促進EPCs的增殖和分化[9]。這些研究結果均闡明，PI3K/Akt能作為促進EPCs增殖、分化的重要因素。Akt是位于PI3K下游的靶蛋白，是細胞內信號傳導途徑中重要的蛋白激酶，也是PI3K/Akt信號傳導途徑的中心環(huán)節(jié)影響蛋白，調節(jié)EPCs的代謝、生長、遷移及增殖過程。Akt的持續(xù)激活是EPCs生存增殖分化和抑制細胞凋亡功能的重要步驟。當膜外刺激信號激活PI3K蛋白后，其與Akt的結構域進行結合，使其信號轉導到胞膜上，通過磷酸化多個底物蛋白，調節(jié)EPCs的分裂增殖、分化和存活[10]。本研究表明，模型組氧化應激模型下，內皮祖細胞Akt蛋白表達明顯下降，PI3K、AKT3 mRNA明顯下降，表明氧化應激反應能影響PI3K/Akt信號，對細胞的增殖分化形成阻礙作用，使EPCs的增殖減弱，細胞凋亡量增加。

Que是一種黃酮類化合物，對其功效研究日益增多，現(xiàn)代藥理學研究證實，Que具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗黏附、免疫調節(jié)等功效，這些功效對于血管修復可以起到作用，使其在心血管疾病的防治修復方面具有廣闊的臨床應用前景。相關研究證實，Que能有效對抗氧化應激所致的內皮細胞凋亡，該功能對于保持血管內皮細胞的生理功能完整性和病理狀態(tài)修復性都是有幫助的，能夠有效減輕內皮細胞受到氧化應激刺激后的各種不良反應[11-12]。但是對于其如何作用于處于氧化應激狀態(tài)下的EPCs，機制尚未明確，本研究從氧化應激相關信號通路入手，研究Que具體抗血管EPCs氧化應激下細胞凋亡的作用機制。

實驗結果顯示，與空白對照組對比，經過氧化氫處理的EPCs增殖能力明顯降低，且通過檢測磷酸化Akt、PI3K和AKT3的含量，從PI3K/Akt信號傳導途徑了解氧化應激對于EPCs的作用點。加入60、90 μmol·L-1Que處理12、24、48 h后，損傷的EPCs細胞增殖能力明顯增加，與模型組對比差異具有統(tǒng)計學意義。同時，明顯升高EPCs磷酸化Akt蛋白的表達，以及PI3K、AKT3 mRNA表達。Que發(fā)揮修復EPCs的作用與調節(jié)細胞內PI3K/Akt表達水平有明顯的相關性，推測Que很可能是通過直接激活氧化應激下的EPCs下游的PI3K/Akt信號通路，來影響EPCs的各種生物學行為。后續(xù)實驗將研究Que對于PI3K/Akt信號通路的作用靶點，深入探討Que對氧化應激血管的修復機制。

(致謝：本實驗在南陽市中心醫(yī)院重點實驗室完成，感謝課題組成員的支持和協(xié)助。)