TGF-α作為體-肺分流性肺動脈高壓診斷生物標志物的研究

袁 雯，孟劉坤，李 君，鄭美麗，李 鷹，劉曉艷

(1. 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院醫學研究中心，北京 100020；2.中國醫學科學院北京協和醫學院國家心血管病中心阜外醫院心血管疾病國家重點實驗室，北京 100037；3. 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院心臟中心，北京 100020)

人體的血液循環包括兩部分，即體循環和肺循環。生理狀態下，體循環為高壓系統，肺循環屬于低壓系統，盡管兩者的起點和終點都是心臟，但兩者的血流在心臟內并無直接的交通和分流。在心臟和大動脈出現畸形和缺損時，可發生體-肺循環分流和繼發肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)。體-肺分流性PAH是一種肺循環血流量增多引起肺小動脈收縮、進行性重構的致死性疾病[1]。一直到目前，右心導管仍然是評價體-肺分流性先天性心臟病相關PAH (congenital heart diaseas associated PAH, CHD-PAH)及血流動力學改變的金標準，但是，右心導管是有創檢查，可能引發嚴重的并發癥，存在一定的風險。超聲心動圖雖是一種無創檢測方法，然而其估測的肺動脈壓力值存在較大的誤差。因此，尋找能協助診斷先天性心臟病PAH的生物標志物意義重大。

轉化生長因子α(transforming growth factor alpha, TGF-α)是由50個氨基酸殘基組成的糖蛋白，可由巨噬細胞、肺泡隔細胞、氣道上皮細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞等合成和分泌[2-4]。TGF-α屬于表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)家族的一員，與細胞表面的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)結合后，激活受體上的酪氨酸激酶，促使細胞內DNA的合成，從而引起細胞增殖、分化等一系列反應。我們近期研究發現其在分流性PAH大鼠及CHD-PAH病人血漿中的濃度均較對照組明顯升高，有望成為體肺分流性PAH的診斷生物標志物。

1 材料與方法

1.1實驗動物♂SD大鼠, 體質量(280±20)g, 30只, 購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號: 2016-0006。術前、術后所有實驗動物均在北京朝陽醫院實驗動物中心清潔級動物房中飼養。

1.2體-肺分流性PAH大鼠模型的構建體-肺分流性PAH大鼠模型的構建方法同之前的報道[5-6]。20只SD大鼠隨機分為聯合手術8周組(combined surgery group reserving for 8 weeks postoperatively, CSG-8W,n=10)和聯合手術12周組(combined surgery group reserving for 12 weeks postoperatively, CSG-12W,n=10)，腹腔注射戊巴比妥鈉(35 mg·kg-1)進行麻醉。

右肺動脈結扎：大鼠取左側臥位，經口氣管插管(16號套管針，BD公司)呼吸機(Inspria ASVP, Harvard Apparatus, Hilliston, Mass, America)輔助呼吸，右側第3肋間入胸腔，仔細解剖出右肺動脈并結扎，逐層關胸；停止呼吸機輔助呼吸，帶氣管插管自主呼吸。大鼠呼吸平穩后，拔出氣管插管。

左側頸部分流：右肺動脈結扎術1周后，行左側頸部分流術。仰臥位固定大鼠，分離并暴露左頸總動脈和頸外靜脈；用顯微縫合線將頸外靜脈懸吊到鄰近的頸部肌肉上以阻斷靜脈血回流；用微血管鉗夾住頸總動脈近心端，結扎遠心端；在分叉前截斷頸總動脈，并立即用肝素生理鹽水(105U·L-1)沖洗，斷端用10/0顯微縫線縫合一針做牽引線，牽引左側頸總動脈穿過長約2 mm的18G套管(18號套管針，BD公司)，然后翻轉固定于套管；將頸總動脈殘端通過頸外靜脈前壁的橫向切口旋轉并插入腔內，結扎；通過分流部位的持續震顫、明顯擴張和頸外靜脈近端部分的顏色變化，直觀地判斷分流部位血流的通暢。最后，將懸垂的縫線和血管夾按順序移除，逐層縫合切口。

1.3假手術組假手術組(sham operation group, SOG,n=10)大鼠的處理也分兩個步驟，除了不結扎右肺動脈和不進行左側頸部分流術外，其余操作完全同CSG-8W與CSG-12W組。

1.4術后處理分流術后d 2開始給予阿司匹林(北京曙光藥業有限責任公司生產，75 mg·kg-1·d-1)和氫氯噻嗪(天津力生制藥股份有限公司生產，25 mg·d-1)以防止吻合口閉塞和肺水腫。

1.5肺血流動力學指標的測量在分流術后8周、12周行肺血流動力學指標的檢測。使用生理記錄儀(Power Lab 16/30,AD Instruments, New Zealand)測量大鼠肺動脈壓力的改變[7]，將13 cm長、尖端彎曲的聚乙烯右心導管(外徑0.9 mm)用肝素生理鹽水預充后，一端連于Powerlab16/30，一端緩慢送入右側頸外靜脈；逆時針緩慢旋轉右心導管，緩慢推進，逐漸進入右心房，右心室和肺動脈主干，右心導管的具體位置以典型壓力波形和波幅來確定；測量過程中，同時記錄右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure, RVSP)、肺動脈收縮壓(pulmonary arterial systolic pressure, PASP)、平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure , mPAP)。

1.6大鼠靜脈血的采集與儲存右心導管測壓完成后，用采血針和EDTA抗凝采血管從下腔靜脈采血4～5 mL；4 ℃靜置0.5 h后，3 000 r·min-1離心15 min；吸取上清，分裝并保存于-80 ℃冰箱備用。

1.7右室肥厚指數的計算取出心臟，用生理鹽水沖洗，把左、右心房及相連的大血管去除，將右心室(right ventricular, RV)、左心室(left ventricular, LV)及室間隔(interventricular septum, IVS)剪下來，濾紙吸干表面水分后稱重。右室肥厚指數(right ventricular hypertrophy index, RVHI)的計算公式如下:RVHI=RV/(LV+IVS)。

1.8先天性心臟病病人血液標本的收集與儲存病人納入標準：納入阜外心血管病醫院2013年7月至2016年1月入院治療，并經超聲心動圖證實的先天性心臟病患者49例，其中不合并PAH患者(CHD組)24例，合并PAH(CHD-PAH組)患者25例。PAH的診斷標準為靜息狀態下經右心導管檢測的平均肺動脈壓≥25 kPa。同時入選20例年齡、性別相匹配的健康志愿者作為對照組(CON組，病人基本信息見Tab 1)。所有病人及健康志愿者均簽署知情同意書。靜脈抽取CON組志愿者、CHD和CHD-PAH組患者2 mL血液，4 ℃靜置0.5 h后，3 000 r·min-1離心15 min；吸取上清，分裝并保存于-80 ℃冰箱備用。

Tab 1 Characteristics of patients involved in this study

ASD:atrial septal defect;VSD:ventricular septal defect;PDA:patent ductus arteriosus;PASP/SBP:pulmonary artery systolic pressure/systolic blood pressure

Fig 1 Plasma concentration of TGF-α increased withprogression of systemic-to-pulmonary shunt-induced PAH

**P<0.01vsSOG;##P<0.01vsCSG-8W

Tab 2 Hemodynamics and right ventricular hypertrophy index of rats

**P<0.01vsSOG;##P<0.01vsCSG-8W

Fig 2 Plasma TGF-α concentration correlated with RVSP, PASP, mPAP and RVHI in rats

A: RVSP; B: PASP; C: mPAP; D: RVHI，1 mmHg=0.133 kPa

1.9大鼠血漿TGF-α濃度的測定大鼠血漿TGF-α濃度的測定使用CUSABIO公司的雙抗體夾心法ELISA試劑盒(貨號：CSB-E07289r)，檢測范圍3.12～200 ng·L-1。具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.10人血漿TGF-a濃度的測定病人血漿中TGF-α濃度的測定使用Abcam公司的雙抗體夾心法ELISA試劑盒(貨號：ab100646)，檢測范圍1 370～106pg·L-1。具體操作按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1動物存活情況動物造模過程中未發生手術操作相關死亡。術后有3只大鼠死亡，其中CSG-8W組1只，CSG-12W組2只，尸檢發現此3只大鼠是由于右心衰竭。其余動物均存活至實驗終點。

2.2模型大鼠血流動力學和右室肥厚指數的評估頸部手術完成后8周(CSG-8W組)和12周(CSG-12W組)，與SOG組比較，CSG-8W和CSG-12W組的RVSP、PASP及mPAP均明顯升高，且這種升高表現為一種分流時間依賴性(Tab 2)。此外，與SOG組相比，CSG組的右室肥厚指數表現出明顯的分流時間相關性的升高，說明聯合手術的方式能明顯誘導肺血流動力學指標的升高和右心室的肥厚，動物模型構建成功。

2.3TGF-α在分流性PAH大鼠血漿中的表達變化ELISA結果顯示，TGF-α在體-肺分流性PAH大鼠血漿中的濃度較假手術組明顯升高，具有分流時間依賴性(Fig 1)。Spearman線性回歸分析顯示，大鼠血漿TGF-α濃度與右心導管測定的右室收縮壓(r=0.775，P<0.01，Fig 2A)、肺動脈收縮壓(r=0.761，P<0.01，Fig 2B)、平均肺動脈壓(r=0.812，P<0.01，Fig 2C)及右室肥厚指數(r=0.742，P<0.01，Fig 2D)均呈明顯正相關。

2.4TGF-α在體-肺分流性CHD-PAH病人血漿中的表達變化ELISA檢測結果表明，TGF-α的血漿濃度在先天性心臟病合并PAH組(CHD-PAH)較先天性心臟心病不合并PAH組(CHD)及正常對照組(CON)均明顯升高，而CHD組與CON組之間TGF-α的血漿濃度差異無顯著性(Fig 3A)。血漿TGF-α的濃度為314 ng·L-1時，診斷CHD-PAH的敏感度為0.760，特異度為0.750，ROC曲線下面積0.895(P<0.01，Fig 3B)。

Fig 3 Plasma concentration of TGF-α in CHD patients

A:The plasma concentration of TGF-α in CHD-PAH patients was significantly higher than that of CON and CHD group, while there was no significant difference between CON and CHD group.**P<0.01vsCON group;##P<0.01vsCHD group. B: Receiver operating characteristic(ROC) curve for TGF-α in diagnosis of CHD-PAH.

3 討論

CHD-PAH主要是由體-肺循環分流導致的肺循環血流量增多，引起肺小動脈收縮、進行性重構的致死性疾病，病變范圍涉及血管全層，以肺血管阻力漸進性升高和肺小血管叢狀病變為特征，并逐漸導致右心負荷過重、衰竭和死亡。CHD-PAH 在各種原因引起的PAH中占10%～20%[9]，是繼特發性PAH、結締組織病相關PAH后的第三大類PAH，嚴重威脅著人類的健康。右心導管是診斷PAH的金標準，然而，導管是一種有創的技術，會增加病人的風險。因此，尋找一種無創、可靠的CHD-PAH診斷方法是CHD-PAH基礎及臨床研究中亟待解決的問題。

作為一種分泌型的蛋白質，TGF-α可作為多種腫瘤相關疾病的生物標志物。Nievergall等[10]發現，血漿TGF-α的水平可以鑒別在治療的第1年未能獲得早期分子反應或進展的慢性骨髓性白血病病人。當TGF-α與腫瘤壞死因子受體II(tumor necrosis factor receptor Ⅱ, TNFR-Ⅱ)、基質金屬蛋白酶組織抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1, TIMP-1)和 C反應蛋白(C-reactive protein ,CRP)合用時，這4個因子是高危黑色素瘤病人生存率重要的預測因素[11]。在晚期非小細胞肺癌病人中，血漿高濃度TGF-α預示了埃羅替尼治療對病人是無益的[12]。Shim等[13]的結果表明，結直腸癌病人術前血清中TGF-α的水平明顯高于對照組，而通過外科手術將腫瘤切除后，病人血清中的TGF-α水平較術前明顯降低。此外，TGF-α的血清濃度在各個階段的胃部、胰腺、結腸、直腸腫瘤病人及晚期食管癌病人中，均較健康對照組明顯升高[14]。然而，TGF-α在CHD-PAH病人血漿中的濃度變化尚不明確。

為了明確TGF-α作為CHD-PAH生物標志物的可行性，我們首先用聯合手術的方法構建了體-肺循環分流性PAH大鼠模型。右心導管檢測的肺血流動力學指標(RVSP、PASP、mPAP)以及右室肥厚指數(RVHI)均在分流手術后8周、12周明顯升高，提示動物模型構建成功。ELISA結果顯示，TGF-α的血漿濃度隨分流時間的延長逐漸升高，并且與肺血流動力學指標及RVHI均呈明顯正相關。這些結果在動物水平表明了TGF-α的血漿濃度與PAH的程度具有正相關，可能作為分流性PAH的生物標志物。

然后，我們檢測了TGF-α在CHD-PAH病人血漿中的濃度變化。與我們的預期一致，TGF-α的血漿濃度在CHD-PAH病人中較CHD組及CON組均明顯升高。血漿TGF-α的濃度為314 ng·L-1時，診斷CHD-PAH的敏感度為0.760，特異度為0.750，ROC曲線下面積0.895(P<0.01)。這就進一步表明，血漿TGF-α水平很可能是診斷CHD-PAH較敏感和特異的生物標志物。

綜上所述，本實驗結果表明，TGF-α的血漿濃度在體-肺分流性PAH發生、發展過程中逐漸升高, 血漿中TGF-α的水平可能是診斷體-肺分流性PAH潛在的生物標志物。

(致謝：本實驗完成于首都醫科大學附屬北京朝陽醫院醫學研究中心，實驗過程中得到研究中心全體老師和同學的幫助，在此表示感謝。)