黃芩苷抗腦缺血藥理學研究進展

趙發(fā)全，崔元璐，范 祥

(天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 300193)

中風是神經(jīng)系統(tǒng)常見病及多發(fā)病，其發(fā)病率和致殘率均高，是導致死亡的主要原因之一，其中缺血性腦中風占80%左右。缺血性腦中風急性期患者主要通過組織纖溶酶原激活物靜脈溶栓治療，由于治療時間窗狹窄，以及腦出血風險增加等副作用，僅有少部分的患者可以從溶栓治療中受益。近年來的研究表明，缺血性腦中風發(fā)病機制主要涉及氧化應激、神經(jīng)凋亡、炎癥反應、血腦屏障破壞等[1]。

黃芩有悠久的應用歷史，始載于《神農本草經(jīng)》，為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效[2]。黃芩苷(7-O-β-D葡萄糖醛酸)是黃芩的主要有效成分，屬于黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗興奮性氨基酸毒性、抗凋亡等生物活性，以及神經(jīng)保護作用[3-5]。大量研究表明，黃芩苷對腦缺血具有神經(jīng)保護作用。為了深入了解黃芩苷的神經(jīng)保護作用機制，本文重點綜述了黃芩苷治療缺血性腦中風的分子藥理機制，為臨床合理用藥提供科學依據(jù)。

1 抗氧化應激

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是造成腦缺血后神經(jīng)元死亡的主要原因之一。最近研究發(fā)現(xiàn)，全腦缺血時產(chǎn)生的過量ROS會破壞神經(jīng)元細胞結構 ，而一些自由基清除劑和抗氧化劑對缺血性腦中風有治療作用。黃芩苷分子式中的酚羥基具有一定的清除自由基和抗氧化作用。Cao等[3]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以提高全腦缺血沙鼠海馬中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、谷胱甘肽(glutathione，GSH) 水平，降低丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量。提示黃芩苷抗腦缺血/再灌注損傷的機制可能與其抗氧化作用有關。Cheng等[6]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以明顯減少腦缺血C57BL/6小鼠腦組織中ROS的生成和MDA含量，同時發(fā)現(xiàn)黃芩苷可以明顯提高過氧化氫損傷的原代神經(jīng)元細胞的生存能力和SOD活性，降低乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)漏出率。此外，研究者還探討了黃芩苷對羥自由基、超氧化物陰離子、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除率的作用，以及對黃嘌呤氧化酶抑制的影響。結果表明，黃芩苷具有清除自由基和抑制黃嘌呤氧化酶的作用。

活性氮(reactive nitrogen species，RNS)是腦缺血/再灌注損傷中重要的神經(jīng)毒性因子，它能加重腦缺血損傷，并觸發(fā)大量分子級聯(lián)反應，易造成血腦屏障滲透率增高、腦水腫、細胞死亡等。過氧硝酸鹽是最具代表的RNS，由一氧化氮和超氧化物陰離子反應生成。已有文獻研究表明，過氧硝酸鹽分解催化劑(peroxynitrite decomposition catalyst，PDCs)可以降低腦缺血大鼠的腦梗死體積、神經(jīng)元死亡和血腦屏障通透性，這提示過亞硝酸根(ONOO-)可能是治療腦缺血/再灌注損傷的潛在靶點。Xu等[7]利用電子順磁共振和質譜儀分析發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以清除超氧化物，并與過氧亞硝酸鹽反應，顯示出較強的抗氧化能力。在黃芩苷對過氧亞硝酸鹽誘導的神經(jīng)毒性或氧糖剝奪/復氧(oxygen glucose deprivation plus reoxygenation，OGD/RO)誘導的人神經(jīng)母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞死亡作用的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以減輕過氧硝酸鹽引起的細胞毒性和OGD/RO導致的細胞死亡。

2 抗凋亡

細胞凋亡是由一系列調節(jié)因子觸發(fā)，并通過凋亡相關基因調控的，其中凋亡相關基因包括Bcl-2家族、caspase、Fas、即刻早期基因(immediate early gene，IEG)和蛋白激酶B (protein kinase B，Akt/PKB)等。腦缺血后,神經(jīng)元損傷是由氧化應激或者線粒體功能損傷引起的，最終激活凋亡級聯(lián)反應。caspase-3是腦缺血后一個關鍵的凋亡執(zhí)行者。大量研究表明，全腦缺血后，腦組織中caspase-3含量明顯增加。Cao等[3]在沙鼠全腦缺血/再灌注模型中，通過RT-PCR和Western blot實驗證實了黃芩苷可以抑制caspase-3 mRNA和蛋白的表達。同時，caspase-3活性測定結果也表明，黃芩苷可以通過抑制沙鼠腦缺血/再灌注后海馬中caspase-3的活性，發(fā)揮抗凋亡作用。

髓細胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1，MCL-1)是Bcl-2家族抗細胞凋亡成員。Zheng等[8]發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以明顯提高腦缺血/再灌注損傷大鼠腦組織和原代神經(jīng)元中Bcl-2、MCL-1的mRNA及蛋白表達。在腦缺血半球中，心肌素相關轉錄因子A(myocardin-related transcription factors A，MRTF-A)表達水平明顯降低，但黃芩苷可以逆轉這一現(xiàn)象，且呈劑量依賴性。在原代皮質神經(jīng)元細胞模型中，MRTF-A siRNA抑制MRTF-A表達后，黃芩苷的抗凋亡作用被明顯抑制。另外，熒光素酶檢測結果提示，黃芩苷可能通過MRTF-A激活CArG box轉錄因子元件，從而升高Bcl-2和MCL-1啟動子活性，發(fā)揮抗凋亡作用。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號通路在哺乳類細胞凋亡中起關鍵作用。哺乳類動物有3種MAPKs亞型：細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶/應激誘導激酶(c-Jun NH2-terminal kinase/stress-activated protein kinase，JNK/SAPK)和p38。有研究表明，敲除小鼠的氨基末端激酶(c-Jun)基因可以明顯抑制海馬神經(jīng)元細胞凋亡。此外，抑制ERK，同時激活JNK和p38信號通路，可以減少大鼠嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞凋亡[9]。Dai等[10]發(fā)現(xiàn)，沙鼠腦缺血/再灌注后，給予200 mg·kg-1黃芩苷可以明顯增強ERK磷酸化水平，降低磷酸化JNK和磷酸化p38的表達，同時ERK、JNK、p38總量不變。結果提示，黃芩苷可能通過激活ERK，抑制JNK和p38通路，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

3 抗炎

炎癥在腦缺血/再灌注損傷中扮演著重要的角色。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)是前列腺素過氧化物合成酶，是花生四烯酸轉化為前列腺素和血栓素中的關鍵酶，其中COX-2是炎癥的標志物，是腦缺血/再灌注損傷中神經(jīng)元凋亡的關鍵酶。過量的COX-2激活和表達會導致嚴重的炎癥反應，進而加劇腦缺血損傷。有文獻表明，COX-2抑制劑可以起到神經(jīng)保護作用。 Cheng等[4]研究表明，黃芩苷可降低全腦缺血大鼠海馬中COX-2的表達。由此推測，黃芩苷的神經(jīng)保護作用可能和抑制腦缺血后COX-2的表達有關。李蓉等[11]發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以改善全腦缺血/再灌注大鼠空間學習記憶能力，并能明顯降低COX-2的蛋白表達水平。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)參與腦缺血損傷的病理過程，并調節(jié)炎癥反應。已有文獻研究表明，TLR2和TLR4能誘發(fā)阿爾茨海默病、帕金森病和腦缺血損傷，它們能激活核因子κB (nuclear factor-kappa B，NF-κB)，促進炎癥反應發(fā)生。NF-κB是炎癥基因的表達調節(jié)因子，能調控可誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、COX-2、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)等。有報道稱，TLR2或TLR4基因敲除小鼠在腦缺血造模后，腦缺血損傷明顯改善。Tu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在永久局灶性腦缺血大鼠模型中，黃芩苷可以降低TLR2/4 mRNA和蛋白表達，降低NF-κB p65、iNOS、COX-2的蛋白表達，以及血清中TNF-α、IL-1β的含量，同時抑制腦缺血大鼠腦組織中iNOS、COX-2的酶活性。提示黃芩苷可能通過TLR2/4通路發(fā)揮抗炎作用。研究者還發(fā)現(xiàn)，腹腔注射黃芩苷(30、100 mg·kg-1)可以明顯降低腦組織中iNOS、COX-2 的mRNA表達，以及caspase-3的蛋白表達。研究結果提示，黃芩苷對永久性腦缺血的保護作用可能與抗炎、抗凋亡有關。

NF-κB p65的激活是造成腦缺血/再灌注損傷和中風患者神經(jīng)元死亡的主要原因。因此，抑制NF-κB p65的激活可以減輕腦缺血/再灌注損傷。Xue等[13]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以通過降低腦缺血/再灌注損傷大鼠腦中NF-κB p65 mRNA和蛋白的表達，發(fā)揮腦保護作用。

Nod樣受體(Nod-like receptors，NLRs)是調節(jié)免疫和炎癥的重要因子。Nod樣受體包含NOD1和NOD2，它們可以激活NF-κB和MAPK通路介導的炎癥反應。Li等[14]研究了黃芩苷對OGD/RO誘導BC2細胞中NOD2和TNF-α的影響。結果表明，黃芩苷給藥30 min后，NOD2和TNF-α的表達下降，這一結果在 PC12細胞實驗中得到了驗證。由此表明，黃芩苷可以通過降低OGD/RO和腦缺血/再灌注損傷中NOD2、TNF-α的表達，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

4 抗興奮性氨基酸毒性

興奮性和抑制性突觸傳導的失衡是腦缺血/再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡的主要原因，其中γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中介導抑制性突觸傳遞的神經(jīng)遞質。GABA能抑制神經(jīng)遞質，從而減緩腦缺血引起的紋狀體損傷。γ-氨基丁酸A型受體(γ-aminobutyric acid A receptor，GABAAR)控制抑制性突觸傳導遞質，其主要亞基類型包含GABAARγ1和GABAARγ2。在成熟的神經(jīng)元中，它們通過氯離子(Cl-)內流，使膜去極化發(fā)揮保護作用。GABAAR介導的Cl-驅動力依賴于細胞內Cl-濃度，它主要通過二級激活轉運機制K+-Cl-(KCC)和Na+-K+-Cl-(NKCC)家族，實現(xiàn)對陽離子氯化物轉運蛋白的調控。KCC介導神經(jīng)元Cl-的外排和NKCC介導Cl-的內流，兩者的失衡使GABAARs由超極化到去極化，進而造成腦缺血損傷。Dai等[10]發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能明顯增加全腦缺血沙鼠海馬CA1區(qū)GABAARγ1和GABAARγ2 mRNA和蛋白的表達。同時，黃芩苷不僅能升高KCC2蛋白的表達，還能降低NKCC1蛋白的表達。提示黃芩苷可能通過調節(jié)GABA能信號通路，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

谷氨酸轉運體-1(glutamate transporter-1，GLT-1)主要在膠質細胞中表達，并負責多數(shù)的谷氨酸運輸，維持細胞內外谷氨酸平衡。有研究報道，GLT-1在腦缺血缺氧中扮演著重要角色。腦缺血后GLT-1表達下調，但增加GLT-1的表達可以緩解腦缺血損傷的進展。Zhou等[15]研究了黃芩苷對缺血缺氧損傷的新生大鼠腦中PI3K/Akt和GLT-1的影響。結果表明，黃芩苷不僅可以明顯降低腦梗死體積、神經(jīng)元損傷和細胞凋亡數(shù)量，還可以升高GLT-1的表達和PI3K/Akt活性。提示黃芩苷可能通過PI3K/Akt通路上調GLT-1的表達，對抗新生大鼠腦缺血缺氧造成的神經(jīng)元損傷。

鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMK Ⅱ)是鈣離子信號通路的關鍵蛋白。有研究報道，CaMK Ⅱ抑制劑可以抑制神經(jīng)興奮性損傷，提示CaMK Ⅱ通路可能是黃芩苷發(fā)揮腦缺血損傷保護作用的另外一條通路[10]。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以逆轉腦缺血海馬神經(jīng)元中鈣離子的內流，升高腦缺血沙鼠海馬和SH-SY5Y細胞中CaMK Ⅱ的表達水平。提示黃芩苷可能通過調節(jié)鈣離子內流和CaMK Ⅱ磷酸化水平，發(fā)揮抗腦缺血損傷作用。

天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptors，NMDARs)是重要的興奮性氨基酸(excitatory amino acids，EAA)受體，主要由3種亞基組成：NR1、NR2(A-D)和NR3(A、B)。鈣離子內流導致caspase-3活性增加，進而引起神經(jīng)元中NMDARs的上調。Zhou等[17]發(fā)現(xiàn)，黃芩苷預處理可以抑制SH-SY5Y細胞OGD/RO后NMDAR 1的蛋白表達。提示黃芩苷可能通過間接抑制NMDARs誘導的EAA，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)是造成腦缺血后EAA毒性的主要物質[18]。甘氨酸(Gly)、牛磺酸(Tau)、GABA屬于抑制性氨基酸(inhibitory amino acid，IAA)，它們可以抑制EAA毒性引起的神經(jīng)細胞過度興奮。Liu等[5]研究了黃芩苷納米顆粒對腦缺血/再灌注損傷大鼠腦脊液中氨基酸神經(jīng)遞質的影響。結果發(fā)現(xiàn)，腦缺血/再灌注后，EAA升高，IAA下降，黃芩苷納米粒預給藥可以明顯升高腦脊液中Gly、Tau和GABA含量，降低Asp、Glu含量。

5 抗凝血酶細胞毒性

凝血酶細胞毒性是造成腦缺血神經(jīng)細胞損傷的主要機制之一，與腦缺血嚴重程度緊密相關。凝血酶是通過蛋白酶活化受體1(protease-activated receptor 1，PAR-1)介導和調節(jié)的，PAR-1在大腦皮質、紋狀體、下丘腦、海馬和小腦中均有分布。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除PAR-1基因后，可明顯降低小鼠腦缺血后腦梗死體積。Ju等[19]研究了黃芩苷對凝血酶誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶誘導6 h內，PAR-1 mRNA和蛋白水平均明顯上升，并且呈劑量依賴性。Zhou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以通過抑制PAR-1 mRNA、PAR-1和caspase-3的表達，改善大鼠腦缺血/再灌注后神經(jīng)功能評分。提示黃芩苷改善腦缺血/再灌注損傷的作用機制可能與抑制PAR-1的表達有關。

6 上調腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)表達

BDNF是促進神經(jīng)元存活、調節(jié)突觸可塑性的神經(jīng)營養(yǎng)因子，可以在全腦缺血時緩解細胞損傷[20]。Cao等[3]利用RT-PCR和Western blot實驗證實，黃芩苷在給藥7 d后，可提高海馬中BDNF mRNA和蛋白表達。

7 上調熱休克蛋白70 (heat shock protein 70，HSP70)表達

HSP70是熱休克蛋白家族中重要的成員，具有分子伴侶、細胞保護等生物學功能，和蛋白質折疊密切相關。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血/再灌注損傷模型中，敲除HSP70基因可以提高小鼠腦梗死體積，HSP70基因過表達小鼠腦梗死體積比正常小鼠明顯下降[21]。Dai等[10]研究發(fā)現(xiàn)，沙鼠全腦缺血后腦組織中HSP70蛋白表達急劇下降，但黃芩苷治療能夠明顯提高HSP70的表達。劉萍等[22]在黃芩苷對局灶性腦缺血/再灌注損傷的保護作用及其機制的研究中證明，黃芩苷可通過提高海馬中HSP70 mRNA和蛋白表達，發(fā)揮對腦缺血/再灌注的保護作用。

8 保護血腦屏障(blood brain barrier，BBB)

BBB控制著中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周之間的物質交換，主要由腦微血管內皮細胞緊密連接構成，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)起到保護作用。基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)屬于蛋白水解酶家族，可導致腦缺血后微血管通透性的增強和BBB的破壞。最近研究表明，MMP-9的過表達可以降解緊密連接蛋白Occludin，破壞BBB中緊密連接完整性，導致BBB通透性增強。Tu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以降低腦缺血大鼠腦組織中MMP-9 mRNA和蛋白表達，從而降低BBB的通透性，同時還能抑制Occludin的降解。我們推斷，黃芩苷可能通過抑制MMP-9的表達和MMP-9介導的Occludin降解，發(fā)揮對腦缺血損傷的保護作用。Chen等[24]還研究了組織纖溶酶原激活物(t-PA)延遲治療腦缺血后，黃芩苷對出血性轉化和BBB破壞的影響。結果表明，ONOO-的產(chǎn)生可以加劇BBB的破壞，黃芩苷作為ONOO-清除劑可以降低腦缺血t-PA延遲治療引起的腦出血風險，保護BBB完整性和減輕腦損傷，這可能與黃芩苷抑制過氧化亞硝酸鹽介導的MMP-9激活有關。

緊密連接(tight junction, TJ)蛋白是參與細胞間緊密連接構成的重要蛋白分子，它擁有眾多磷酸化位點，影響著腦內皮連接復合物分解的進程。磷酸化TJ蛋白(包含claudin-5、Occludin 和ZO-1)的重分布，會導致腦血管內皮細胞依附連接的改變， BBB的跨內皮細胞間電阻下降和滲透性增加。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，具有調節(jié)細胞增殖和表達等功能，主要涉及從膜受體到細胞核信號轉導。Zhu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷在OGD誘導BALB/c小鼠腦微血管內皮細胞(BMVECs)模型中，能夠明顯促進claudin-5和ZO-1在BBB中的轉錄和表達。研究還表明，黃芩苷不僅能促進claudin-5 和 ZO-1的表達，維持TJ完整性，還能降低內皮細胞PKC水平、缺氧狀態(tài)下TJ 蛋白磷酸化作用和TJ分解及重排的可能性。說明黃芩苷可能通過降低TJ 蛋白磷酸化，恢復腦缺血狀態(tài)BBB的功能。

9 促進神經(jīng)再生

神經(jīng)干細胞/祖細胞(neural stem/progenitor cells，NSPCs)可能在修復神經(jīng)系統(tǒng)損傷過程中扮演重要角色。NSPCs可以被誘導成神經(jīng)細胞，并向缺血損傷周圍腦區(qū)遷移。Mash-1為堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)轉錄因子家族成員，是哺乳動物早期神經(jīng)分化發(fā)育的關鍵基因，它可以促使NSPCs向神經(jīng)元分化，在神經(jīng)再生過程中起重要作用。有研究表明，黃芩苷可以在分化初期誘導NSPCs向神經(jīng)元分化。Zhuang等[26]研究黃芩苷對NSPCs和腦缺血/再灌注大鼠海馬神經(jīng)元再生的作用機制時發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以上調Mash-1 mRNA和蛋白的表達，促進腦缺血/再灌注后海馬齒狀回中新生細胞數(shù)量。提示黃芩苷促進腦缺血/再灌注損傷后神經(jīng)元的再生可能與上調Mash-1基因表達有關。

10 小結

黃芩作為傳統(tǒng)中藥，在我國已有數(shù)千年的應用歷史。黃芩苷是黃芩的主要藥效成分，也是現(xiàn)代藥理學研究中的明星化合物。黃芩苷對缺血性腦中風的保護作用可能與抗氧化、抗炎、抗興奮性毒性和促進神經(jīng)再生作用有關。盡管現(xiàn)已有黃芩苷的藥理學研究，但是目前研究仍然不夠深入，建議進一步開展以下方面研究：①開展黃芩苷現(xiàn)代制劑研究。生物藥劑學研究表明，黃芩苷可以在腦缺血狀態(tài)下累積，但其水溶性差、生物利用度低，限制了黃芩苷在臨床研究的應用。我們可以通過納米給藥系統(tǒng)改善黃芩苷生物利用度，提高受體敏感度，使藥物更易進入細胞發(fā)揮作用。②應用多組學聯(lián)合分析方法，全面系統(tǒng)地研究黃芩苷分子藥理機制，并開展轉錄組學、蛋白組學、代謝組學等研究，發(fā)現(xiàn)新的作用通路與靶點，加強研究的深度和針對性，設計出高效的黃芩苷神經(jīng)保護劑。