縫隙連接蛋白Connexin43參與神經精神疾病發病機制的研究進展

劉 諾，王真真，陳乃宏

(中國醫學科學院藥物研究所&神經科學中心，北京 100050)

Cx43蛋白是構成縫隙連接(gap junction，GJ)的縫隙連接蛋白(connexin，Cx)家族主要成員之一。通過GJ實現物質能量交換，有效維持了體內的生理生化穩態。本文就GJ的結構與功能，Cx43蛋白的編碼基因、結構解析、合成、細胞膜定位、調節和在人體中所發揮的生理功能，以及其在相關神經系統疾病發病進程中所扮演的角色等方面的研究進行綜述。

1 GJ的結構及功能

GJ介導的細胞間通訊是最直接和最主要的細胞間信號傳導方式，可以快速且可逆地達成相鄰細胞對外界所傳達信號的共同反應。GJ的結構組成和功能發揮的基本元件是縫隙連接蛋白Cx，其連接子(Connexon)即半通道由6個Cx亞基環繞中間孔道(直徑1.5～2.0 nm)橫跨細胞膜形成 ，最后中央親水性孔道對接形成GJ。GJ允許小分子及離子通過(相對分子質量小于1.2×103，如ATP、cAMP、鈣離子等)[1]，從而通過其介導的縫隙連接細胞間通訊(gap junction intercellular communication，GJIC)調節細胞的基本生命過程，維持穩態平衡。GJ通道的開放關閉和通透性受多種因素調控，如pH值、鈣離子濃度、膜電位、原癌基因的激活和抑制、生長因子和蛋白激酶數量的改變等[2]。已知的GJ功能包括：①傳遞信號；②緩和有害物質毒性；③介導受損細胞的修復；④參與代謝；⑥參與細胞的黏附及運動[3]。

2 Cx43的編碼基因和結構解析

人類Cx家族由同一基因轉錄而來，高度相關。其中，Cx43是由平均長度為923 bp的3條DNA鏈編碼，作為沒有經過突變的抑癌基因存在。人類組織中的Cx43編碼基因位于2個位點：一個功能基因存在于第6對染色體上，一個假基因存在于第5對染色體上。部分常染色體隱性突變是由于第6對染色體上功能基因的3’末端被插入1個堿基。Cx43基因的增強子包括3個部分：①轉錄起點前的TATA框(-25, -18)；②促進區(-64, -55)；③抑制區(-93, -87)。Cx43在眾多器官中發揮作用，如腦、皮膚、心臟，分布廣泛[4]。Cx43有3個膜內部分、2個膜外部分和4個親油跨膜區。其中，氨基端、羧基端及細胞質環存在于膜內，而便于識別和對接相鄰細胞的部分則存在于膜外。單個Cx43可以聚合形成六聚體連接子，幾個連接子在經過高爾基體轉運到達細胞膜上之后，聚集成為GJ斑，其數目與細胞間通訊的順暢性呈正相關。而蛋白羧基端的磷酸化會影響其功能的發揮，這種磷酸化主要發生在絲氨酸和蘇氨酸殘基上。

3 Cx43蛋白的轉錄翻譯和細胞膜定位

Cx43是按照傳統的途徑合成的，即粗面內質網上的核糖體以核內基因轉錄得來的mRNA為模板，翻譯成蛋白質，后經囊泡轉運至高爾基復合體，聚合成連接子，并進行相應的翻譯后修飾[5]。成熟的半通道需到達細胞膜上后，與另一個細胞的半通道進行對接，才能參與到細胞與細胞間的生理進程中。

關于合成的半通道定位于細胞膜的具體機制，有研究顯示，Cx43從高爾基體運送到細胞間連接斑處是由微管蛋白完成的，β-catenin、p150、N-cadherin也在此過程發揮重要作用。然而，具體機制不是很清楚，可能與Cx43羧基末端的特定功能位點有關。另外，肌動蛋白的數量與Cx43運輸至細胞膜的數量呈正相關，研究表明，敲除β-actin基因會影響GJ的數量。可見，多種蛋白共同參與到Cx43的轉運定位過程，其中某些蛋白的分布或功能發生異常，可能是Cx43相關疾病的致病原因。

4 Cx43蛋白的功能調節

研究表明，Cx43的功能調節位點大多數位于羧基端[6-7]。Cx43羧基末端(C)的磷酸化和去磷酸化主要通過蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)及Src家族的酪氨酸激酶進行調節，從而改變Cx43縫隙連接效應，由此介導激素、炎癥遞質和生長因子的生理功能[8]。研究發現，不同途徑通過磷酸化羧基端不同位點，影響GJ的通訊功能，PKC途徑作用于368和262位點，MAPK途徑作用于282、279和252位點[9]。酪氨酸激酶途徑則通過使Cx43蛋白的247位點和268位點磷酸化，阻礙GJ的通訊功能，Cx43的268位點發生磷酸化是由于酪氨酸激酶作用于Cx43的C末端，并與其SH3(Src同源結構域)結合，這種磷酸化又可以提供潛在的酪氨酸激酶SH2結合位點，使得Cx43的247位點發生磷酸化，從而調節通道的關閉。

在Cx43結合蛋白中，緊密連接蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)對GJ功能有著重要影響，這是通過與Cx43蛋白相互作用實現的。研究發現，ZO-1會影響GJ斑的形成和功能，這是通過與羧基端末端殘基結合，促進GJ開放實現的。ZO-1還能調節半通道開放，這是因為沒有參與到GJ形成的Cx因其作用而聚集。結合蛋白中的c-Src與磷酸化的Cx43結合，可以關閉細胞間GJ通道[10]。另外，通過FRET和Co-IP研究顯示，調節蛋白有利于GJ發揮正常生理功能，其機制是與細胞骨架F-actin結合，并作用于Cx43羧基末端[11]。

5 縫隙連接蛋白Cx43的生理功能及其參與神經系統疾病病理進程的機制

神經系統的各種細胞，如神經元、室管膜細胞、神經膠質細胞，它們的物質代謝和同種細胞之間的信息傳導是依靠GJ完成的。研究發現,室管膜細胞的鈣離子外流與半通道的開放密切相關[12]。神經系統GJ和半通道的主要構成蛋白是Cx43蛋白，Cx43蛋白對于其功能的發揮有著重要的調節作用。

神經元的興奮同步化和過度興奮抑制與GJ有關。Cx43蛋白調節GJ通道，直接參與神經元電突觸聯系中細胞間動作電位的傳導，從而使兩個相鄰神經元的興奮間隔縮短到可忽略不計的程度[13]。Cx43蛋白還通過插入突觸后膜電位，抑制過度興奮，從而保證了神經元外的環境穩態和突觸功能的穩定[14]。

星形膠質細胞間的電信號傳導頻率很高，主要與Cx43蛋白構成的GJ密切相關。離子交換即細胞偶聯，需要縫隙連接蛋白改變構象來完成，由Cx43蛋白和Cx30蛋白參與，其中比較重要的過程包括由G蛋白偶聯受體介導和調節的Cx43蛋白磷酸化和脫磷酸化，脫磷酸化同樣離不開磷酸酶的調節，而且需要人內皮素1(endothelin 1，ET-1)和1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)的介導[15]。有關研究顯示，Cx43介導細胞內谷氨酸鹽的釋放，表現為其受體被拮抗時，谷氨酸鹽外流中止[16]。除了介導GJ的相關功能之外，Cx43高表達還可以保護膠質細胞免受凋亡信號的影響，GJ的抑制劑不會影響這種作用。

目前，Cx43蛋白相關的病理機制主要出現在缺血/再灌注腦損傷、創傷性腦損傷以及抑郁癥的發病過程中。

5.1Cx43蛋白與大腦缺血/再灌注損傷缺血/再灌注損傷的形成與細胞間偶聯密切相關，代謝偶聯和信號傳導可以將有害物質和凋亡信號迅速傳導到缺血病灶周邊細胞。大部分研究者認為，GJ介導大腦缺血/再灌注時，缺氧壞死產生物質和凋亡信號的傳遞，造成缺血周圍區域的繼發損害，導致大量神經元的不可逆損傷。研究發現，一系列海馬區域缺血/再灌注模型中，星形膠質細胞GJ的數量越多、密度越大，神經元的損害就越嚴重，而造模并應用GJ拮抗劑48 h后，細胞死亡數目與單純造模組相比明顯減少。另有研究者認為，Cx43蛋白與缺血/再灌注損傷后的細胞生存有關。研究發現，若抑制半通道的作用，損傷后的病灶周邊區域細胞生存情況明顯變差，而吸入氧氣所帶來的Cx43表達增加，則有利于損傷修復[17]，而且，缺血時，Cx43高表達刺激半通道的進一步開放帶來的ATP分解代謝增加，會產生有神經保護作用的腺苷，這都可以證明Cx43同樣具有保護缺血/再灌注損傷的作用。因此，合理控制Cx43的表達既可以緩解缺血/再灌注損傷的擴散，又能促進腦組織修復的進行，可以作為臨床治療的新靶點。

5.2Cx43蛋白與創傷性腦損傷研究發現，創傷性腦損傷的各個病理階段中，與無損傷對照組相比，Cx43均表現出高表達。早期，一方面Cx43表達增加帶來的GJ功能增強，會加速缺氧壞死產生的毒性物質的擴散，使病變部位周邊細胞凋亡增多，擴大病變范圍；另一方面，由于半通道的開放增多，谷氨酸鹽大量釋放，發揮其神經興奮性毒性作用，帶來腦水腫的進一步惡化[18]。后期，高表達的Cx43會促進GJ介導神經修復營養物質的傳遞，減輕損傷程度。

5.3Cx43蛋白與抑郁癥越來越多的證據顯示，星形膠質細胞與抑郁癥的發病密切相關。有研究發現，抑郁癥患者的尸檢結果中，星形膠質細胞的數目減少，形態發生了明顯改變[19]。星形膠質細胞在腦中形成網絡，并通過GJ進行信息交流[20]。公認的研究結果是，Cx43蛋白在星形膠質細胞中大量合成。Sun等[21]的研究發現，前邊緣皮層注射GJ抑制劑甘珀酸和Cx43模擬肽段Gap26、Gap27，使大鼠表現出抑郁的典型癥狀——快感缺失，證明星形膠質細胞GJ的功能障礙，在抑郁癥的發病中起著重要作用，正常Cx43蛋白的存在對于GJ信息交流功能的正常行使必不可少。該項研究的Western blot和RT-PCR實驗結果顯示，經典抑郁模型——慢性不可預知性應激使Cx43的mRNA含量和蛋白含量均明顯下降，而經典抗抑郁藥，如氟西汀和度洛西汀可以逆轉這種改變，進一步證明了Cx43蛋白減少在抑郁癥發病中的意義，以及5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI)類藥物發揮抗抑郁作用的機制中包含恢復Cx43蛋白的正常水平[21]。

5.4Cx43蛋白與癲癇Jordan等[22]對切除的癲癇患者發病相關腦區組織進行了Northern印跡分析，發現星形膠質細胞的縫隙連接蛋白Cx43 mRNA表達量明顯升高。這可能是因為發病部位神經元過度同步化放電，導致胞外K+含量大幅度增加。為了盡快清除過多的K+、恢復正常的內環境，Cx43蛋白代償性表達上升，增加的GJ數量使清除面積增大，從而有助于神經元周圍環境恢復穩態。這表明Cx43蛋白表達升高與癲癇發病機制相關。

5.5Cx43蛋白與神經膠質瘤研究表明，神經膠質瘤細胞的Cx43蛋白表達水平與大多數腫瘤相似，呈較低水平，明顯低于正常的星形膠質細胞[23]。同時，正常膠質細胞進行癌基因轉染或使用致癌劑誘導后，Cx43蛋白表達水平明顯降低。另有研究發現，膠質瘤細胞的增殖速度在經過Cx43基因轉染后明顯降低，很可能是因為GJ形成增加[24]。這表明Cx43蛋白表達促進GJ構建，可以抑制腫瘤的形成和發展。

6 結語

縫隙連接蛋白Cx43是構成GJ的重要成分之一，GJ介導物質能量交換，有效維持了體內的生理生化穩態。神經系統細胞間分布著豐富的GJ和半通道，Cx43蛋白作為星形膠質細胞GJ重要成分之一，其表達異常與大腦缺血/再灌注損傷、創傷性腦損傷、抑郁癥、癲癇、神經膠質瘤等神經系統疾病發病密切相關。對Cx43蛋白的編碼基因、結構、合成、細胞膜定位、功能調節等的深入研究，將有助于我們尋找相關疾病的新的藥物治療靶點，為新藥研發奠定基礎。