聯合檢測EGR-1與HER-2在卵巢癌中的表達及意義＊

柯燦燦，繆振忠，王芬

(1.南昌大學，南昌 330006；2.南昌大學第一附屬醫院婦產科，南昌 330006)

卵巢癌是女性生殖系統腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤[1]。2015年我國約有52100例女性被確診為卵巢癌，約22500例女性死于卵巢癌[2]。近些年來，我們在卵巢癌的治療方面取得諸多進展，但晚期卵巢癌患者5年生存率并沒有得到有效提高，一直徘徊在30%[3]左右，其最主要的原因在于缺乏早期有效的篩查手段，導致大多數患者確診時已為晚期。因此，如何提高卵巢癌的早期診斷成為了改善卵巢癌患者預后最有效的途徑[4]。腫瘤標志物在腫瘤的診斷、腫瘤病人病情監測以及判斷腫瘤預后的方向有著十分重要的作用，近年來，腫瘤標志物的發現依然是腫瘤學者的研究熱點[5]。

HER-2為人表皮生長因子受體家族成員之一，它是其它家族成員的共受體，可形成同源或異源二聚體，從而啟動一系列信號轉導通路，激活酪氨酸激酶活性啟動一系列信號轉導通路介導細胞的增殖、分化、抗凋亡等過程從而參與多種腫瘤的發生，這一論點已被國內外廣泛公認[6]。目前已知Her-2基因擴增和蛋白過表達能幫助判斷HER-2陽性乳腺癌、胃癌患者的預后情況[7]。有研究表明，Her-2可作為卵巢癌的1個獨立預后因素，Her-2的高表達與卵巢癌的預后呈負相關[8]。但也有研究表明Her-2的過表達與卵巢癌的預后無相關性[9]。本研究可進一步證實Her-2與卵巢癌預后的關系。

早期生長反應因子1（EGR-1）是一種早期生長反應基因，屬于轉錄因子鋅指蛋白家族成員。它可以在幾分鐘內激活一系列信號通路，其活性在數小時內即衰退。滲透壓改變、熱休克、缺氧、DNA損傷、輻射損傷等應激都會刺激EGR-1的表達。EGR-1通過多種通路調節細胞的增殖、分化和凋亡。但是，目前關于EGR-1在卵巢癌中的發生、發展中起到什么樣的作用還未有明確的報道。本研究運用免疫組化的方式檢測EGR-1蛋白在卵巢癌的表達情況，探討EGR-1在卵巢癌的發生、發展的過程中的作用與意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2012年1月到2013年6月80例在南昌大學第一附屬醫院進行卵巢癌手術的病例，病例臨床、病理資料均完整，術前未進行過化療、放療和細胞因子等治療，未合并有其他腫瘤或嚴重合并癥（高血壓、糖尿病，其他急慢性疾病等）作為研究組C組。80例OC病人（漿液性癌51例、粘液性癌21例、其他類型的8例）的臨床病理資料：患者年齡35～78歲，中位年齡56歲，根據國際婦產科聯盟(FIGO)分期：Ⅰ-Ⅱ期23例，Ⅲ-Ⅳ期57例；按照組織學分級為高分化9例，中分化29例，低分化42；有淋巴轉移57例，無淋巴轉移23例。根據取材的標準，對照組選40例因婦科良性疾病需切除或活檢所取得的卵巢良性腫瘤組織為B組，同樣選取20例正常的卵巢組織為A組，所有患者都經排除未患有其他惡性腫瘤或合并其他系統急慢性疾病。

1.2 實驗主要試劑與試驗方法 主要試劑：兔抗人EGR-1多克隆抗體和兔抗人HER-2多克隆抗體購自美國ABclonal公司進口，濃縮DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

實驗方法：將已經收集好的石蠟包埋的組織標本，逐個放置于切片機上，將蠟塊與刀刃的位置和角度調好之后，制成5μm，邊緣整齊平整的組織切片2張，而且卵巢癌患者蠟塊要求每個組織切片中均含有瘤巢。免疫組化的操作步驟按照說明書進行烤片脫水、脫蠟、水化-高溫高壓抗原熱修復-滴加一抗-4°C冰箱中保存過夜-放入PBS緩沖液中清洗后滴加二抗-DBA染色-蘇木精復染、分化返藍——脫水、封片。其中一抗中抗EGR-1抗體稀釋濃度為1：100；抗HER-2抗體稀釋濃度為 1：150。

1.3 HER-2、EGR-1的免疫組織化學染色結果判定 HER-2的陽性結果主要定位于細胞膜或者細胞漿內，其陽性反應表現棕黃色。根據細胞核或者細胞漿染色的深淺以及染色的范圍來進行判定，結果判定如下：⑴按照陽性細胞百分數：陰性則0分，陽性細胞≤5%計1分，6%-50%記2分，50%-75%計3分，＞75%則4分。⑵按照切片染色強弱來評分：棕褐色表現3分，棕黃色表現2分，淡黃色表現計1分，無色記錄0分。免疫組化陽性分4個等級 （計算方法：⑴⑵）：0-2分表現為-（陰），3-4分為+，5-8分為++，9-12分為+++。

EGR-1的陽性結果主要存在于細胞核，棕色顆粒顯色位于細胞核才是陽性。根據細胞核染色的深淺以及染色的范圍等情況來進行綜合的判定。⑴按照陽性細胞百分數：陽性細胞≤25%計1分，25%-50%記2分，50%-75%計3分，＞75%則 4分。⑵按照染色染色強度評分標準：細胞不著色記1分；細胞著色稍稍高于背景色記2分；細胞著色強度高于背景色記3分；細胞核著色呈深褐色，明顯高于背景色記4分。最終的染色指數為該標本染色陽性細胞百分與染色強度兩者的乘積，以染色指數來判定免疫組化的結果：評分為1-2分屬于低表達，評分3-16分是高表達。

1.4 隨訪 研究組患者臨床、病理及基本資料齊全建檔。所有患者出院后進行隨訪，手術后第1年，對患者每3個月隨訪1次；術后第2年每4-6個月1次。截止日期2018年3月，隨訪期如果患者出現死亡或消失聯系不上者則終止隨訪。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件對結果進行統計，計數數據運用χ2檢驗，5年生存率采用Kaplan-Meier進行分析該二者表達對OC患者預后影響。

2 結果

2.1 HER-2蛋白在3組中的表達 在80例OC患者、40例良性卵巢腫瘤組織、20例正常卵巢組織的石蠟組織切片中，HER-2蛋白表達陽性率分別為 42.5%（34/80）、0.25%(1/40)、0.00%（0/20）， 卵巢癌患者與良性卵巢組織以及正常卵巢組織表達有明顯的差異，有統計學意義（P＜0.05）（如表 1），而良性卵巢組織和正常卵巢組織表達差異（P＞0.05）。

2.2 EGR-1蛋白在3組中的表達 在80例卵巢癌患者、40例良性卵巢腫瘤組織、20例正常卵巢組織的石蠟組織切片中，EGR-1均產生表達，但是EGR-1在其中的低表達率分別為 60%（48/80）、10%(4/40)、15%（3/20）， 差異有統計學意義 （P＜0.05）。 見表 2。

表1 HER-2蛋白在EOC及正常卵巢組織中的表達

表2 EGR-1在EOC及正常卵巢組織中的表達

2.3 HER-2在OC中的表達與臨床病理指標間的關系 在OC中，HER-2蛋白陽性率表達組間比較，根據數據統計，HER-2的陽性率的表達均與卵巢癌的FIGO分期、淋巴節是否轉移有關 （P＜0.05），但是與年齡、病理類型、病理分級無關（P＞0.05）。見表 3。

2.4 EGR-1在OC中的表達與臨床病理指標間的關系 在OC中，EGR-1蛋白的高低表達組間比較，根據數據統計，EGR-1的低表達率與卵巢癌的FIGO分期、組織分化程度、淋巴節是否轉移有關 （P＜0.05），但與年齡、病理類型無關（P＞0.05）。 見表 4。

2.5 HER-2與EGR-1與OC患者預后的關系 對80例卵巢癌患者隨訪時間60月，中位隨訪時間為52月，受訪的OC患者5年總生存率是46.1%，中位生存時間是52.8個月。根據Kaplan-Meier生存曲線分析，HER-2陽性表達患者其5年生存率低于陰性表達患者，（20.7%VS 47.8%，P=0.004）。EGR-1低表達患者其5年生存率為20.1%，高表達者為52.6%，組間比較差異有意義（P=0.005）。而HER-2(+)EGR-1低表達組的5年生存率（18.18%）與HER-2(-)EGR-1高表達組的表達組5年生存率（80%）相比，組間差異有統計學意義（P≤0.05），說明HER-2表達以及EGR-1表達的高低可能與預后相關。

3 討論

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居于婦科惡性腫瘤首位，嚴重威脅女性健康[10]。卵巢癌起病隱匿，臨床上缺乏早期篩查手段，發病人群缺乏特異性，導致70%的患者確診時已屬卵巢癌晚期，而晚期患者5年生存率往往不足30%，但是早期卵巢癌患者5年生存率能夠達到90%[1]。因此，尋找卵巢癌的早期腫瘤標記物是改善患者預后的關鍵。

3.1 HER-2與卵巢癌 HER-2癌基因是一種促癌基因，一般情況下HER-2只會在胎兒時期有表達，但是成年以后，在極少組織內發現其在低的水平表達于細胞表面，正常組織僅可測到少量的HER-2/neu基因，正常情況下，不會導致腫瘤的發生。而有些因為內或者外界因素原因的刺激下，HER-2/neu基因可能還會轉化為活性癌基因，從而導致正常細胞的迅速分裂，過度增殖，良性腫瘤中無HER-2過表達，HER-2基因在惡性腫瘤的發生和發展過程中起重要的作用甚至向惡性轉化如肺腺癌，乳腺癌，卵巢癌等癌癥中存在過度表達[11，12]。

表3 HER-2在OC中的表達與臨床各指標之間的關系

表4 EGR-1在OC中的表達與臨床各指標之間的關系

HER-2與臨床病理特征以及預后的關系研究結論有很多的不一致。劉云春[13]、李明玉[14]等研究中都表示HER-2蛋白過表達與卵巢癌的FIGO分期、有無淋巴結轉移有關，而與組織學的分級、病理學類型沒有相關性。但是也有另外一些學者主張[15]的研究結果不支持以上結論，他們認為HER-2與臨床病理特征沒有相關性。

本研究表明，HER-2的表達隨著FIGO分期增高其陽性表達率逐漸增高，HER-2蛋白的表達與卵巢癌患者是否出現淋巴轉移有關，出現淋巴結轉移，其表達增高，提示其惡性程度高以及患者不良預后。但是其陽性表達與年齡、組織病理分化程度、臨床病理類型無關。

3.2 EGR-1與卵巢癌 EGR-1屬于即刻早期基因家族成員之一，是一種含有特殊的3個鋅指結構的轉錄因子，該基因定位于5q31，長2.1kb，編碼3.3kb成熟的mRNA。EGR-1基因編碼的EGR-1蛋白包含DNA結合域、抑制結構域和活化結構域這三個部分。EGR-1的DNA結合域是在鋅離子的存在下，鋅指結構與DNA序列中的富含GC區 （CGCCCCGC）結合，從而發揮轉錄調控作用。NGFI-A結合蛋白1或2可以通過與EGR-1的抑制結構域結合從而引起EGR-1生物活性的抑制[16]。

EGR-1能夠在血清、胰島素、內皮素、維甲酸等多種調控因子的作用下發生轉錄。在參與調控細胞的生長、損傷、修復相關多種基因的表達的過程中同時也受多種因素調控，如電離輻射、缺氧神等[17]。EGR-1基因表達的功能主要在接受外界信號刺激后，基因表達的產物在細胞內的信號傳遞，通過信號通路的級聯反應從而調控下游靶基因的表達，實現相關的生物學功能[18]。

細胞的正常生長以及分化均與EGR-1基因的激活緊密相關，而正常細胞的失分化是腫瘤發生發展的過程中的重要環節。研究發現，EGR-1蛋白結合位點位于含有多種生長因子基因和原癌基因的啟動子區域中，因此，EGR-1基因的激活與腫瘤的發生可能有關。Ronski等[19]研究表明，EGR-1在絕大多數的腫瘤中都呈現低水平的表達，例如肺癌、纖維肉瘤及平滑肉瘤、甲狀腺癌、膠質母細胞瘤、乳腺癌等，在人惡性骨髓瘤和ER陰性乳腺癌中EGR-1基因甚至是無表達的，對于這些腫瘤來說，EGR-1可能起到抑制腫瘤細胞生長的作用。在乳腺癌細胞中EGR-1是呈低表達狀態的，但是在服用他莫昔芬治療后EGR-1與正常乳腺組織的表達水平沒有統計學的差異[20]。Levin等[21]研究發現，非小細胞肺癌組織中EGR-1表達量明顯是低于癌旁組織，這個結果提示EGR-1表達的下調與肺癌發生是有密切關系的。既往的實驗研究也已經證實了EGR-1可以抑制多種腫瘤細胞的生長，如肝癌、乳腺癌、纖維肉瘤、膠質母細胞瘤、食管癌等[19]。從以上的研究推斷。所以我們可以推斷，EGR-1可能是這些腫瘤的抑制基因。

本研究我們發現EGR-1在卵巢癌組織中的表達與FIGO分期，分化程度以及淋巴結轉移有關，FIGO分期越高，分化程度越低，伴有淋巴結轉移，EGR-1表達越低；而與年齡和病理分型無關。這說明EGR-1在卵巢癌中扮演著抑制基因的角色。

EGR-1基因與腫瘤的關系頗為復雜，它與癌基因和抑癌基因的關系、對靶基因調節的分子機制等尚未完全清楚，對放射誘導后相關基因表達變化以及對放射敏感性的影響國內外研究較少，對這些問題的不斷深入研究和解決將對真正實現腫瘤個體化放療將產生重大影響，使廣大患者通過基因檢測就可預測放療療效成為可能。

本研究運用免疫組化的方法檢測HER-2，EGR-1在卵巢癌的表達情況，后期實驗可以聯合檢測HER-2，EGR-1在血清中與組織中的表達，觀察其是否可以成為新的卵巢癌的腫瘤標記物，為卵巢癌的早期診斷提供新的方法。