結(jié)核與非結(jié)核病人感染凝固酶陰性葡萄球菌的耐藥性及耐藥基因mecA分析＊

王錦萍 ，王軍 ，蔡常輝 ，梁連輝

(廣東省中山市第二人民醫(yī)院，1.檢驗科；2.門診部，中山 528400)

結(jié)核是一種慢性傳染性疾病，嚴(yán)重危害著人類的健康，據(jù)報道全世界每年新發(fā)生結(jié)核病800萬-1000萬，每年約有100萬-300萬人死于結(jié)核病。[1-3]2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告顯示：全國15歲及以上人群活動性肺結(jié)核的患病率為459/10萬，估算為499萬例。[4]據(jù)報道，結(jié)核合并感染革蘭氏陽性球菌中以CNS為主[5]，但在臨床檢測中經(jīng)常把CNS當(dāng)作非致病菌而漏檢。為探討結(jié)核合并感染CNS的耐藥性，減少其多重耐藥發(fā)生，為抗結(jié)核合并感染提供指導(dǎo)，本研究對比分析2014年11月至2016年3月本院結(jié)核合并感染CNS與非結(jié)核感染CNS的耐藥情況，并檢查其耐藥基因mecA，報道結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》中相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]挑選肺結(jié)核患者，其他部位結(jié)核按照臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)判斷。2014年11月至2016年3月本院患者確診CNS感染的99例患者中，按是否感染結(jié)核將患者分為A、B兩組，A組(54株)為確診結(jié)核病患者分離株，標(biāo)本來源于痰液32株、血液7株、分泌物3株、胸水6株、尿液3株，腦脊液2株，大便1株，所占比例分別為59.3%、13.0%、5.5%、11.1%、5.5%、3.7%、1.9%。B 組(45株)為非結(jié)核病患者分離株。標(biāo)本來源于血液22株、痰液7株、分泌物 7株、胸水3株，尿液 3株、大便3株，所占比例分別為48.9%、15.6%、15.6%、6.7%、6.7%、6.7%。衛(wèi)生部購入質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923作室內(nèi)質(zhì)量控制。

1.2 主要儀器及試劑 PHOENIX-100型全自動微生物鑒定儀(美國BD公司)，革蘭氏陽性鑒定藥敏復(fù)合板(美國BD公司)；Cobas z 480 PCR擴(kuò)增儀(瑞士羅氏公司)；B100生物安全柜(濟(jì)南鑫貝西公司)；電泳儀(北京市六一儀器廠)；恒溫金屬浴儀(上海培清公司)；寶生物工程（大連）有限公司：購買蛋白酶K、EX Taq聚合酶、瓊脂糖凝膠、DL2000 DNA Marker，合成PCR引物序列。

1.3 CNS鑒定及藥敏試驗 99株CNS經(jīng)PHOENIX-100型全自動微生物鑒定儀 (美國BD公司)進(jìn)行菌種鑒定及藥敏敏感性試驗。根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會 （CLSI）2015年文件（M100-S25）進(jìn)行藥敏試驗結(jié)果判讀。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 利用WHONET 5.4版軟件對兩組CNS藥敏數(shù)據(jù)進(jìn)行耐藥性分析。采用SPSS 13軟件包對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料選用Z檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 耐藥基因mecA檢測

1.5.1 DNA引物 設(shè)計mecA基因引物[7]，序列長度533bp。 上游引物（5’3’）：AAAATCGATGGTAAAG GTTGGC；下游引物（5’3’）：AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC。

1.5.2 PCR提取與擴(kuò)增試驗 挑選純培養(yǎng)物單個菌落于含有蛋白酶K溶液的離心管里，于金屬浴中55℃消化1h，增加至95℃滅活10min，最后放進(jìn)小型離心機(jī)中以12000r/min離心5min，留取上清液（DNA模板）存于-20℃冰箱待用[8]；取PCR擴(kuò)增管加入 1μl DNA 模板，1μl上游引物，1μl下游引物，12.5μl EX Taq聚合酶，補(bǔ)充9.5μl滅菌純水組成25μl反應(yīng)體系；把含25μl PCR反應(yīng)液的擴(kuò)增管放入Cobas z 480 PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增 （擴(kuò)增系數(shù)：10min 94℃預(yù)變性、30s 94℃變性、30s 52℃退火、60s 72℃延伸，共30個循環(huán)；最后10min 72℃延伸）；PCR 產(chǎn)物在 4℃保存[9]。

1.5.3 電泳及成像 PCR產(chǎn)物與溴甲酚藍(lán)指示劑混合后點樣，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像并拍照。

2 結(jié)果

2.1 PCR法檢測耐藥基因結(jié)果 采用PCR擴(kuò)增法檢測99株CNS的耐藥基因mecA，部分結(jié)果見圖1；A組54株結(jié)核合并感染CNS中檢出mecA基因50株，檢出率為92.5%；B組45株非結(jié)核感染CNS中檢出mecA基因38株，檢出率為84.4%。

圖1 部分CNS的mecA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 CNS的菌株類別（見表1）

2.3 CNS對抗菌藥物的耐藥率 采用PHOENIX-100型全自動微生物鑒定儀對A、B兩組的CNS進(jìn)行菌種鑒定及藥物敏感性試驗，藥物敏感性試驗為微量肉湯稀釋法（MIC法），對表1不同菌種的藥敏試驗中挑選17種相同的抗菌藥物進(jìn)行對比。藥敏結(jié)果顯示，A組結(jié)核合并感染的CNS，耐苯唑西林凝固酶陰性葡萄球菌（MRCNS）檢出率為92.6%，青霉素耐藥率達(dá)96.2%，紅霉素、慶大霉素和四環(huán)素耐藥率分別為85.2%、75.9%和25.9%；B組非結(jié)核合并感染CNS，耐苯唑西林凝固酶陰性葡萄球菌（MRCNS）檢出率為86.7%，青霉素耐藥率達(dá)93.3%，紅霉素、慶大霉素和四環(huán)素耐藥率分別為80%、60%和20%；兩組均未發(fā)現(xiàn)耐萬古霉素耐藥株，詳見表2。采用秩和檢驗計算兩組數(shù)據(jù)的耐藥率 Z=-2.935，P=0.003＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明A組比B組耐藥性高。

表1 CNS的菌株分類

表2 CNS對抗菌藥物的耐藥率

3 討論

近年來由于結(jié)核耐藥率逐漸增加，且結(jié)核患者由于營養(yǎng)狀況，經(jīng)濟(jì)，依從性以及合并感染其他慢性疾病等因素，影響結(jié)核患者的預(yù)后[10]。而凝固酶陰性葡萄球菌為臨床常見革蘭氏陽性球菌，隨著醫(yī)院治療中各種侵入性操作增多，大量使用激素和免疫抑制劑等因素，CNS已成為世界范圍內(nèi)醫(yī)院感染的重要致病菌。[11]在結(jié)核合并感染革蘭氏陽性球菌中，CNS占首位，且具有廣泛的、嚴(yán)重的耐藥性，本研究通過A組（結(jié)核合并感染）與B組（非結(jié)核感染）兩組CNS對多種抗菌藥物耐藥性比較，采用統(tǒng)計學(xué)方法得出，結(jié)核合并感染的CNS比非結(jié)核感染的CNS耐藥性更高，并具有顯著性差異。而且對兩組CNS均進(jìn)行耐藥基因mecA檢測，檢出率與耐藥性相符。

從表2看，A組結(jié)核合并感染的54株CNS中，耐藥率從大到少依次是：青霉素＞紅霉素＞氨芐西林＞環(huán)丙沙星＞慶大霉素＞阿莫西林/克拉維酸＞克林霉素＞妥布霉素＞利福平＞復(fù)方新諾明＞四環(huán)素＞阿米卡星＞替考拉寧＞奎奴普丁/達(dá)福普汀＞萬古霉素＞呋喃妥因；B組非結(jié)核感染的45株CNS中，耐藥率從大到少依次是：青霉素＞紅霉素＞氨芐西林＞環(huán)丙沙星＞克林霉素＞慶大霉素＞妥布霉素＞阿莫西林/克拉維酸＞利福平＞復(fù)方新諾明＞四環(huán)素＞替考拉寧＞阿米卡星＞奎奴普丁/達(dá)福普汀＞萬古霉素＞呋喃妥因。除了替考拉寧、奎奴普丁/達(dá)福普汀和呋喃妥因A組比B組的耐藥率低外，其他抗菌藥物的耐藥率均為A組比B組高。與相關(guān)報道一致[12，13]，萬古霉素仍是治療葡萄球菌的有效治療抗菌藥物。

PCR擴(kuò)增法檢測99株CNS的耐藥基因mecA，了解β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥機(jī)制。本研究中從A組結(jié)核合并感染患者中分離的CNS中，PCR法與MIC法檢出率均為92.6%，50株MRCOS檢出了mecA基因；從B組非結(jié)核患者中分離的CNS中，PCR法檢出率為84.4%，而通過MIC法檢出率為86.7%，39株MRCOS只有38株檢出了 mecA基因；PCR法檢測B組MRCOS中有1株沒有檢出mecA基因，考慮與mecA基因存在異質(zhì)性改變有關(guān)[14]，但兩組MRCNS的耐藥性及耐藥基因檢出率基本相符。因而可以推斷mecA基因在結(jié)核和非結(jié)核感染的MCNS中有很高攜帶率，嚴(yán)重耐藥性不容小覷。

MRCNS的耐藥基因可分為：獲得性基因mecA、獲得性基因TEM基因，突變性基因fem基因，編碼失常的sar基因、編碼失常的arg基因和編碼失常的mgr基因等等，導(dǎo)致葡萄球菌對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥。產(chǎn)青霉素酶葡萄球菌通過破壞β-內(nèi)酰胺環(huán)從而對青霉素耐藥；MRSCNS多攜帶mecA基因，編碼低親和力青霉素結(jié)合蛋白2α（PBP2α），替代葡萄球菌青霉素結(jié)合蛋白 2（PBP2）完成肽聚糖和細(xì)胞壁的合成，細(xì)菌不僅沒有被滅活而且因替換蛋白從而獲得抗藥性。據(jù)戰(zhàn)曉薇[15]等報道，mecA基因多位于葡萄球菌染色體mec基因盒（SCCmec）中，其序列長度超過 30000bp，可攜帶mecA基因復(fù)合物、轉(zhuǎn)座子和整合質(zhì)粒的毒力島，因此除引起β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥外，還會引起各種非β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥。相關(guān)報道[16]還顯示，CNS具有較高生物被膜形成能力，絕大部分為MRCNS，且表現(xiàn)為多重耐藥性。MRCNS不僅導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，同時也導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類和氟喹諾酮類藥物耐藥，因此，我們從臨床分離的MRCNS均表現(xiàn)為廣泛、多重耐藥的特征，而結(jié)核合并感染的MRCNS對比非結(jié)核合并感染的MRCNS表現(xiàn)更為明顯。結(jié)核病多以肺部感染為主，患者多表現(xiàn)為咳嗽咳痰、胸痛、低熱等癥狀，經(jīng)排除治療未愈，通過CT、涂片等檢查，再結(jié)合肺結(jié)核指南才可最后確診，期間很長一段時間是通過抗生素治療，常規(guī)經(jīng)驗性用藥多采用β-內(nèi)酰胺類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類藥物及廣譜抗生素 （三代頭孢），在廣譜抗菌藥物的篩選作用下容易產(chǎn)生耐藥菌株定植；肺結(jié)核確診后，需要長期使用抗結(jié)核藥物治療，患者肝腎損傷嚴(yán)重，免疫力低下，定植耐藥菌株得以繁殖；加上侵入性治療如支纖鏡吸痰及糖皮質(zhì)激素治療等因素，均為MRCNS提供有利的生存條件。而非肺結(jié)核病的確診難度比肺結(jié)核更高，臨床醫(yī)生排除時間更長，更有利于耐藥菌株的產(chǎn)生。

綜上所述，結(jié)核合并感染的CNS對比非結(jié)核感染的CNS，特別是MRCNS，PCR法與MIC法相互印證其準(zhǔn)確性，而結(jié)核合并感染的MRCNS引發(fā)的多重耐藥特性比非結(jié)核合并感染的MRCNS更強(qiáng)。耐藥基因mecA是MRS的金標(biāo)準(zhǔn)，它不但可在同種細(xì)菌內(nèi)傳播，更可通過不同種類細(xì)菌間傳播，必須警惕其嚴(yán)重的耐藥性。