牛乳中硝基呋喃代謝物檢測技術(shù)研究進展

朱寧，趙艷坤，蔡建星，安靜，陳賀

（新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（烏魯木齊）/新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實驗室，烏魯木齊 830091）

硝基呋喃類藥物是人工合成的具有5-硝基基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物，由于其強毒性和致癌性，已引起世界各國的高度重視，我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定動物源性食品中呋喃唑酮的限量為不得檢出[1]。硝基呋喃類藥物被用于小牛體內(nèi)，治療痢疾等腸道疾病。與此同時，若奶牛食用含有硝基呋喃成分的飼料添加劑，則不可避免地造成牛乳中硝基呋喃代謝物的殘留，給牛奶帶來嚴重的質(zhì)量安全隱患[2]。

常見的硝基呋喃類藥物有4種，即呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林和呋喃唑酮。呋喃類物質(zhì)在動物體內(nèi)穩(wěn)定性較差，能迅速分解，其代謝產(chǎn)物分別為3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）、氨基脲（SEM）、1-氨基乙內(nèi)酰脲（AHD）和5-甲基嗎啉代-3-氨基-2-唑烷酮（AMOZ），可以與組織蛋白結(jié)合形成穩(wěn)定的化合物，殘留時間長達數(shù)周之久。這些代謝物在弱酸性條件下可從蛋白質(zhì)中釋放出來( 如人類胃液的酸性條件)，因此當人類食用了含有硝基呋喃類抗生素殘留的食品后，其在胃液里釋放出來被人體吸收，對人類健康造成危害[3]。通用的牛乳加工方法難以使蛋白結(jié)合態(tài)硝基呋喃殘留物降解，長期食用含有此類物質(zhì)的牛奶，會打亂體內(nèi)菌群平衡[2]，嚴重的會產(chǎn)生溶血性貧血、血小板減少性紫癜和多發(fā)性神經(jīng)炎等[4]，因此了解、歸納牛奶中硝基呋喃代謝物的檢測原理、檢測技術(shù)并用于指導實踐，對牛奶質(zhì)量安全具有重要意義。

本文主要介紹牛奶中硝基呋喃代謝產(chǎn)物檢測技術(shù)及發(fā)展趨勢，包括前處理方法、儀器測定方法。

1 樣品前處理

由于硝基呋喃代謝物在酸性條件下才能從蛋白質(zhì)中釋放出來，因此通用的樣品前處理方法是先使樣品在酸性條件下水解，再加試劑使其衍生化，經(jīng)過提取、凈化等步驟，最后上儀器測定[5]。

1.1 樣品衍生化

1.1.1 什么是樣品衍生化

衍生化是為了增加分子質(zhì)量，使化合物不在高噪音背景下，增加特征碎片離子的選擇性，提高質(zhì)譜響應。硝基呋喃代謝物衍生化一般在37℃過夜進行，親核基團R-NH在酸性催化環(huán)境會很快游離出來與2-NBA碳酰基發(fā)生化學作用[6]，增加代謝物的離子化效率，水解后生成硝基苯衍生物。衍生試劑大多選擇2-硝基苯甲醛(2-NBA)，也可以選擇2，4-二硝基苯甲醛、2-羥基-5-硝基苯甲醛[7]。

1.1.2 硝基呋喃代謝物衍生化的必要性

(1) 從硝基呋喃結(jié)構(gòu)看，其代謝物極性相對較強， 它們的結(jié)構(gòu)易和色譜柱硅膠表面重金屬發(fā)生螯合形成“二次保留”，造成死吸附、降低感度、峰形展寬拖尾、與相關(guān)雜質(zhì)及基質(zhì)的分離度不佳，嚴重影響結(jié)果判斷[8]。

(2) 從液相色譜儀利用的紫外-可見檢測器分析看，硝基呋喃結(jié)構(gòu)的紫外光譜吸收不明顯，靈敏度過低[8]，經(jīng)衍生化后紫外吸收加強，使其檢測限可以達到1.0μg/kg。

(3) 從質(zhì)譜檢測分析看，硝基呋喃類代謝物的相對分子量較小、離子化效率低、 離子碎片無特征性， 直接進行質(zhì)譜測定時會造成較大困難。對硝基呋喃類藥物的代謝物進行衍生有利于質(zhì)譜檢測時離子碎片的選擇[8]。

蒙君麗等人在研究分析中，使牛奶樣品與2-硝基苯甲醛進行反應，對硝基呋喃類代謝物進行衍生化，加入0.5mol/L三氯乙酸5mL，加入0.05mol/L衍生化試劑2-硝基苯甲醛（二甲亞砜溶解）0.2mL，37℃衍生化16h[3]，結(jié)果使目標化合物的離子化達到最佳水平，試驗中各化合物都得到了較好的色譜峰形。

測定牛奶中硝基呋喃類藥物代謝物時，樣品基質(zhì)蛋白、脂肪等干擾物質(zhì)較多，影響最終的定性定量結(jié)果。所以，硝基呋喃代謝物經(jīng)衍生化后，需要進一步的提取和凈化，才可用于檢測，得到準確的檢測結(jié)果。

1.2 硝基呋喃代謝物的提取凈化

硝基呋喃類代謝物屬于獸藥成分的一類。針對獸藥殘留檢測，常用的提取凈化方法有液液萃取法、固相萃取法、凝膠滲透色譜、免疫親和色譜、超臨界流體萃取、分子印跡等[9]。現(xiàn)在最常用的方法為液液萃取法和固相提取法。

1.2.1 液液萃取法

在硝基呋喃代謝物提取凈化過程中，幾種硝基呋喃類抗生素及其代謝物可能同時殘留在介質(zhì)中，衍生后的特性和溶解性不同，利用其組分在溶劑中的不同溶解度可達到分離提取的目的[7]。液液萃取凈化方法簡單，并且可以大大縮短凈化時間，但是提取物范圍較廣泛，特別是對于牛奶這種基質(zhì)復雜的樣品，會造成共提出物質(zhì)較多。Freitas 等[10]與 Storey 等[11]建立的方法利用液液萃取卻有不錯的回收率，可以滿足幾十種獸藥殘留同時定量檢驗的要求。樣品溶液的pH對萃取效率有很大的影響，丁濤等[12]試驗不同pH值對回收率的影響，發(fā)現(xiàn)pH值為7～7.5時，AHD、AOZ、SEM和AMOZ代謝物的衍生產(chǎn)物提取效率最高。

1.2.2 固相萃取法

固相萃取是在液液萃取的基礎(chǔ)上建立的一種凈化方法，填料為一般硅膠鍵合固定相，基于固體填料與樣品中的目標化合物產(chǎn)生各種作用力，將目標物與樣品基質(zhì)分離，再用洗脫液洗脫，達到分離和富集目標化合物的目的。固相萃取分離效率高，處理樣品的容量大，使用有機溶劑少。蒙君麗等采用Oasis HLB固相萃取柱，用5mL甲醇、5mL水活化，再使樣品備用液全部過柱[3]，取得較好的效果。

由于牛奶樣品中的高蛋白、高脂肪，采用液液萃取較容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，需要加入去乳步驟，從而延長了試驗操作時間。根據(jù)分離模式不同，相對于液液萃取，固相萃取具有高效、快速、重現(xiàn)性好、凈化效果佳、少用有毒有害溶劑、環(huán)保、經(jīng)濟的優(yōu)點。商品化的固相萃取小柱也越來越多樣化。對于牛奶中硝基呋喃代謝物的檢測，固相萃取方法更為適合。

2 樣品的儀器檢測方法

2.1 高效液相色譜法( HPLC)

高效液相色譜法是最早被采用的硝基呋喃類藥物檢測方法。高效液相色譜大多用于硝基呋喃原藥化合物的檢測。該法的優(yōu)點是自動化、精確度高，假陽性率低，缺點是儀器昂貴、操作繁瑣、樣品處理復雜、成本高、廢棄試劑易造成環(huán)境污染，并需要專業(yè)分析人員。

通常采用高效液相色譜結(jié)合紫外檢測器測定硝基呋喃類藥物代謝物，在檢測中由于呋喃結(jié)構(gòu)的紫外光譜吸收不明顯，導致靈敏度過低，經(jīng)衍生化試劑衍生化后，可產(chǎn)生強紫外吸收，但是復雜的基質(zhì)還會導致測定困難和干擾。用高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)檢測硝基呋喃代謝物，已有對4種硝基呋喃類藥物同時檢測的方法，但由于樣品基質(zhì)復雜，會對實驗結(jié)果造成干擾，所以在前處理過程中必須嚴格按照要求凈化。此方法過程較繁瑣、復雜，需要花費大量的時間和試劑，同時在應用中也有一定的局限。該方法若要在硝基呋喃類藥物殘留檢測中廣泛應用還需要不斷的改進。Angelini等[13]利用LC-UV方法檢測牛肌肉組織中4種硝基呋喃類藥物的殘留，方法的檢測限是1mg/kg，定量限是2mg/kg，平均回收率76%。

2.2 高效液相色譜配合質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS)

近些年來，高效液相色譜配合質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS)在硝基呋喃代謝物殘留的檢測中越來越多地被采用，相信也可以被引入到牛乳測定中。目前，色譜技術(shù)廣泛應用于多組分混合物的分離和分析，質(zhì)譜儀可對單一組分提供高靈敏度和特征的質(zhì)譜圖，質(zhì)譜檢測器具有穩(wěn)定性好、定量準確、抗干擾能力強、檢測限低、測定快速等特點[1]。LC-MS 是一種靈敏度高、選擇性好、特異性強、可快速分析確證硝基呋喃類藥物殘留的方法。但是缺點同高效液相色譜法一樣，儀器設(shè)備的購置和運行費用較高，檢測過程中涉及大量的有機溶劑，對環(huán)境污染較大，周期也比較長[14]，距成為常規(guī)分析方法尚有一定距離。荷蘭瓦郝尼罕RIKIL T-DLO實驗室建立了完整的LC-MS法用于檢測呋喃唑酮代謝物 AOZ 及其他代謝物[15]。

由于牛乳中幾種硝基呋喃類抗生素及其代謝物可能同時殘留，所以與LC-UV相比，LC-MS更適合牛乳中硝基呋喃代謝物的檢測。

2.3 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在色譜部分對試樣中的各個組分進行分離，在質(zhì)譜檢測器入口被離子化，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖[7]。HPLC-MS/MS 也被廣泛應用于測定各種復雜基質(zhì)樣品中的硝基呋喃類代謝物，該方法在對被測化合物的定量上有更高的可信度，同時具有相對較高的靈敏度，比液相色譜法的靈敏度高10倍以上，還具有更高的選擇性和精密度，對于假陽性問題，HPLCMS/MS 法可以利用待測分子的結(jié)構(gòu)來定性，排除酶聯(lián)免疫方法和高效液相色譜法檢測的假陽性結(jié)果，用以確證檢測結(jié)果。歐盟目前認為 HPLC-MS 只能用于對硝基呋喃代謝產(chǎn)物進行篩選實驗，對檢出的陽性結(jié)果必須再用 HPLC-MS/MS 進行確證[16]。余建新等[17]采用微量化樣品前處理技術(shù)，以鄰硝基苯甲醛為衍生劑和電噴霧正離子多反應監(jiān)測方式，建立了蜂蜜及水產(chǎn)品中4種硝基呋喃類抗生素代謝物殘留量同時測定的液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)方法。方法的檢出限為0.02～0.3ng/g，線性范圍均＞102，線性方程的相關(guān)系數(shù)r＞0.997，回收率79.0%～95.6%。柳毅[5]用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測動物源性食品中硝基呋喃代謝物，得到呋喃它酮代謝物、呋喃西林代謝物、呋喃妥因代謝物和呋喃唑酮代謝物的檢測限均為0.50μg/kg；在0.50～10.0μg/kg添加濃度的回收率均≥70%；相對標準偏差RSD≤15%。

2.4 化學發(fā)光免疫法（酶聯(lián)免疫法，ELISA）

化學發(fā)光是當基態(tài)分子吸收化學反應中釋放的能量躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子以光輻射的形式返回到基態(tài)時產(chǎn)生的光。基于化學發(fā)光強度和被測物含量之間關(guān)系建立的分析方法叫化學發(fā)光分析法[18]。在此基礎(chǔ)上，將化學發(fā)光與免疫分析方法相結(jié)合，得到諸多發(fā)光免疫分析研究成果。發(fā)光免疫分析是將發(fā)光分析和免疫反應相結(jié)合而建立的一種新型超微量分析技術(shù)，該技術(shù)不但具有超過放射免疫的高靈敏度，而且具有酶聯(lián)免疫的操作簡便、快速的特點，且測試中不使用有害的試劑，試劑保存期長，穩(wěn)定性好，檢測范圍寬，可實現(xiàn)在不需要衍生的情況下直接測定其代謝物，從而大大減少了時間和成本。缺點是經(jīng)常會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，抗干擾能力相對較弱。國內(nèi)外關(guān)于硝基呋喃類抗生素免疫分析方法的報道很少。現(xiàn)有文獻報道的ELISA方法優(yōu)點是靈敏度高、操作簡便、檢測迅速[7]，但不能作為確認方法，同時由于ELISA方法特異性較強，故僅能對單一組分進行檢測，無法同時一次性檢測樣品中的呋喃唑酮及AOZ、呋喃它酮及AMOZ、硝基呋喃妥因及AHD、硝基西林及 SEM。Chang等[19]采用ELISA測定可食性動物組織中呋喃唑酮代謝物時以苯甲醛作為衍生化試劑，生成苯AOZ的衍生物進行檢測，回收率為55.8%～99.6%。

目前國外已有檢測呋喃唑酮、呋喃它酮代謝物的商品化試劑盒開發(fā)出來。我國謝世紅等[20]建立了用四合一免疫膠體金快速檢測試劑板同時快速檢測水產(chǎn)品中殘留的4種硝基呋喃類代謝物殘留的方法。結(jié)果表明，該方法檢測速度快、時間短，準確率高；最低檢出限為AOZ 1.0μg/kg、SEM 1.0μg/kg、AMOZ 2.0μg/kg、AHD 2.0μg/kg；假陽性率小于5%，假陰性率為0；對實際樣品的檢測結(jié)果與儀器方法一致。若運用于牛乳中估計會有顯著的效果。

3 我國的現(xiàn)有標準

3.1 關(guān)于高效液相色譜

農(nóng)業(yè)部1077號公告-2-2008 水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定、農(nóng)業(yè)部1486號公告-8-2010 飼料中硝基呋喃類藥物的測定，均采用高效液相色譜法測定，其中農(nóng)業(yè)部1486號公告-8-2010的檢測限可達0.3mg/kg，定量限為1.0mg/kg。

DB34/T 1838-2013 、DB34/T 1839-2013中分別規(guī)定了動物源性組織和水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法，儀器采用高效液相色譜配熒光檢測器，其中DB34/T 1839-2013 適用于產(chǎn)品的風險預警監(jiān)測及相關(guān)科學研究。

3.2 關(guān)于液相色譜-質(zhì)譜

SN/T 2061-2008 進出口蜂王漿中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定、DB22/T 1614-2012 蛋及乳制品中硝基呋喃代謝物殘留量的測定，均規(guī)定采用液相色譜-質(zhì)譜法。

3.3 關(guān)于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

GB/T 21311-2007 、GB/T 20752-2006規(guī)定了動物源性食品中包括肌肉、內(nèi)臟、魚、蝦、蛋、奶、蜂蜜和腸衣中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量的檢測方法，均規(guī)定采用高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定四種硝基呋喃代謝物AOZ、AMOZ、AHD、SEM的殘留，其中GB/T 20752-2006四種殘留物的檢出限均達到0.5μg/kg。適用于定性確證和定量測定。

農(nóng)業(yè)部781號公告-4-2006 動物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定、農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定，也均規(guī)定采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

SN/T 2061-2008 蜂王漿中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定、GB/T 21167-2007 蜂王漿中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定，也均規(guī)定采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

3.4 關(guān)于酶聯(lián)免疫法

SN/T 3380-2012 出口動物源食品中硝基呋喃代謝物殘留量的測定采用酶聯(lián)免疫吸附法，本標準適用于雞肉、豬肉、小龍蝦、回魚、牛奶、蜂蜜等動物源食品中AOZ、AMOZ、SEM、AHD殘留量的檢測。

DB34/T 2253-2014 水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留的檢測采用膠體金免疫層析法，適用于魚、甲魚、龜肌肉組織和去殼蝦、蟹及腸腺的可食用組織中四種硝基呋喃代謝物的快速篩查檢測，檢出限均為1.0μg/kg。

SB/T 10927-2012 酶聯(lián)免疫吸附法僅適用于以上產(chǎn)品的風險預警監(jiān)測及相關(guān)科學研究。

4 結(jié)論

國內(nèi)目前對于牛乳中硝基呋喃代謝物的檢測技術(shù)研究較少，由于牛乳不耐儲存，且高脂肪、高蛋白，使得前處理過程中基質(zhì)干擾多，易于乳化，一般需要較長的流程。因此需要開發(fā)一種快捷方便的檢測方法，先對牛乳中硝基呋喃類代謝物進行快速篩查，再進一步進行定量分析，以取得更為準確的結(jié)果。發(fā)光免疫試劑盒技術(shù)剛好能滿足這一特性，若能進一步提高其靈敏度、準確性、穩(wěn)定性、回收率，使其接近或者優(yōu)于液譜檢測法，將會有深遠意義，值得我們深入研究和開發(fā)。