查菲埃立克體致病機制研究進展

程 琰，于學杰，王縛鯤

查菲埃立克體(Ehrlichiachaffeensis)是一種寄生于單核細胞內的革蘭氏陰性菌，屬于立克次體目、無形體科、埃立克體屬。該病原菌于1987年首次被報道，1991年從病人血液中分離。其所致的疾病稱為人單核細胞埃立克體病(Human Monocytotropic Ehrlichiosis, HME)，是一種經蜱傳播的人獸共患病。人單核細胞埃立克體病在美國主要分布在中部及東南部地區，世界范圍內查菲埃立克體感染的報道逐年上升[1]，分子流行病學研究證明，我國也存在人埃立克體病[2-6]。

查菲埃立克體通過細菌效應蛋白(TRP120、透明質酸酶、EtpE等)與細胞表面受體相互作用的方式粘附和入侵宿主細胞[7-10]，寄生在胞質空泡中，以膜包裹的包涵體形式生存和繁殖[11]。本文就查菲埃立克體在宿主細胞內持續生存機制的研究進展做一綜述。

1 抑制宿主免疫應答

1.1細胞壁缺乏脂多糖和肽聚糖 單核巨噬細胞可表達模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)，如Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRS)和NOD(nucleotide-binding oligomerization domain)，這些受體可以識別和結合保守的病原相關模式分子(pathogen-associated molecular patterns)，如脂多糖和肽聚糖，啟動宿主的天然免疫應答來清除入侵致病菌。然而，查菲埃立克體缺乏編碼肽聚糖和脂多糖生物合成的基因[12]，因此無肽聚糖和脂多糖與模式識別受體結合，從而不能有效激活宿主的天然免疫應答。

1.2抑制或增強促炎細胞因子產生 查菲埃立克體感染不能有效地誘導宿主產生IL-6、TNF-α等促炎細胞因子，從而抑制了宿主抗病原的免疫反應[13]。盡管在查菲埃立克體感染早期(48 h內)TNF-α的表達水平未增高[14]，但在感染后第5 d，TNF-α的表達水平增高近30倍。查菲埃立克體分泌的效應子Ank200(200-kDa ankyrin-repeat protein)可能通過與TNF-α基因啟動子區結合誘導宿主細胞的TNF-α表達[15]。研究表明，在感染后第7天，過表達TNF-α或血清中高濃度TNF-α與HME的致死性密切相關[16]。

另有研究[17]發現，查菲埃立克體感染可降低多種細胞因子的表達，如IL-12、IL-15、IL-18等。這些細胞因子是具有多重生物學活性的促炎細胞因子，它們可激活NK細胞和輔助性T細胞產生IFN-γ，IFN-γ又可激活巨噬細胞吞噬殺傷致病菌。IL-12、IL-15也可以激活NK細胞和細胞毒性T細胞直接殺傷胞內菌寄生的宿主細胞。查菲埃立克體感染導致的IL-12、IL-15、IL-18表達水平下調，可抑制宿主的天然和獲得性免疫應答，促進其持續感染。

1.3抑制IFN-γ IFN-γ具有促進抗胞內菌免疫應答的作用，其可激活NK細胞和Tc細胞直接殺傷細菌感染的宿主細胞，也能夠增強巨噬細胞吞噬和處理細菌的能力，并呈遞細菌抗原誘發特異性免疫應答。在查菲埃立克體感染早期，利用重組人IFN-γ處理感染細胞，IFN-γ可通過抑制宿主細胞內的轉鐵蛋白受體，顯著降低細胞內鐵含量，從而抑制病原體的生長[18]。然而，在查菲埃立克體成功感染宿主細胞后，蛋白激酶A被激活，Jak-Stat信號通路受抑，使IFN-γ表達下調和鐵含量上升，從而有利于其在宿主細胞內生長[19]。研究[20]表明，查菲埃立克體的效應子TRP47(47-kDa tandem-repeat protein)可以通過與宿主細胞靶蛋白PTPN2(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2)相互作用，負向調節Jak-Stat信號通路去抑制IFN-γ表達。

1.4抑制Toll樣受體 Toll樣受體屬于I型跨膜糖蛋白，胞外區具有數量各異的亮氨酸富集重復片段結構域，胞內區由與IL-1受體結構相似的信號傳導結構域組成，能夠識別入侵的病原體，激活細胞免疫應答，是參與宿主天然免疫的一類重要蛋白質分子，并且在特異性和非特異性免疫中發揮橋梁作用。研究[21-22]表明，TLR2/4參與的免疫應答能夠促進機體對查菲埃立克體的清除。然而，在查菲埃立克體感染過程中，ERK1/2、p38 MAPK信號通路被抑制，TLR2、TLR4、CD14及相關細胞因子的表達水平降低，進而有利于其在胞內存活。

2 雙組分系統調控作用

雙組份系統(two-component system，TCS)是原核生物及真核生物細胞響應外界環境刺激的一種信號轉導系統。細菌通過感受外界環境變化后分泌相應毒力因子來維持其自身生存，是細菌應對選擇壓力的一種機制。由組氨酸激酶和反應調節子組成的雙組份系統，其作用機制是由外界信號分子作用于組氨酸激酶的膜外配體結合域，使組氨酸發生自我磷酸化，并將磷酸基團轉移到反應調節子上，進而產生一系列的調控反應。通過序列和結構分析，查菲埃立克體基因組中具有3個組氨酸激酶(NtrY、PleC、CckA)及相應的反應調節分子(NtrX、PleD、CtrA)。有研究[23]證明，重組的查菲埃立克體NtrY、PleC、CckA具有組氨酸殘基依賴的自身激酶活性，使組氨酸發生自我磷酸化，并將磷酸基團轉移到相應的反應調節子上。Closantel為一種組氨酸激酶的抑制劑，體外實驗表明其可抑制查菲埃立克體組氨酸激酶活性。查菲埃立克體感染宿主細胞前用Closantel進行預處理，可阻斷感染；在感染宿主細胞一天后加入Closantel，可清除感染。此外，查菲埃立克體感染宿主細胞5～10 min內加入Closantel，可導致三個組氨酸激酶(NtrY、PleC、CckA)及相應的反應調節子(NtrX、PleD、CtrA)基因表達水平下調。這些結果提示，雙組份系統在促進查菲埃立克體感染中發揮重要的調節作用。

3 抑制吞噬體與溶酶體的融合

吞噬體與溶酶體融合形成的吞噬溶酶體可清除胞內病原體。在吞噬溶酶體內，在多種酶的作用下通過氧依賴和氧非依賴系統殺滅和消化病原體，這是機體非特異性清除入侵病原體的免疫防御機制之一。

免疫熒光標記技術分析發現，查菲埃立克體吞噬體表面缺乏溶酶體標識分子CD63和LAMP-1(lysosomal-associated membrane protein 1)，提示吞噬體未與溶酶體融合。進一步研究發現，查菲埃立克體吞噬體表面具有早期吞噬體標識分子Rab5(Ras related protein 5)及其效應子EEA1(early endosomal antigen 1)，并可選擇性地募集轉鐵蛋白受體[24-25]。利用芯片微陣列分析證明，查菲埃立克體感染能夠抑制宿主細胞的Rab5、SNAP23(synaptosomal associated protein, 23 kDa)、STX16(syntaxin 16)等膜轉運相關基因的轉錄，該抑制作用在感染的最初1 h內尤為顯著[17]。由這些結果推測，盡管查菲埃立克體吞噬體獲得了Rab5，但其抑制了吞噬體的發育成熟和與溶酶體的融合，使其獲得充足時間在吞噬體內生長繁殖。然而，查菲埃立克體抑制吞噬體溶酶體融合的機制尚不清楚。

4 抑制宿主細胞凋亡

細胞凋亡是機體維持內環境穩定的一種由基因控制的自主有序的細胞死亡，也是宿主細胞殺傷胞內寄生菌的一種天然防御機制。查菲埃立克體感染宿主細胞后的最初1 h內，上游激活信號引起NF-κB抑制性配體IκB降解，激活p38MAPK通路，導致NF-κB水平上調，抑制宿主細胞凋亡。此外，查菲埃立克體誘導凋亡抑制因子IER3、BIRC3、BCL2的表達，感染早期則抑制凋亡誘導因子BIK和BNIP3L的表達，從而阻止宿主細胞凋亡，有利于埃立克體在宿主細胞內繼續生存[17]。

另有研究發現，在未感染的DH82細胞中，線粒體分布于核周區域；在查菲埃立克體感染后，線粒體聚集在埃立克體包涵體周圍。進一步研究發現，埃立克體感染導致線粒體代謝活性受抑，但線粒體具有膜通透性，由此推測致病菌可能通過分泌效應子與線粒體相互作用，穩定線粒體膜通透性，而另一方面，致病菌抑制線粒體代謝活性，使線粒體“休眠”，“休眠”的線粒體不能啟動細胞凋亡，由此認為穩定線粒體膜通透性可能與抑制細胞凋亡相關[26]。

研究發現查菲埃立克體Ⅳ型分泌系統(T4SS)效應子ECH0825在其處于指數生長期時表達升高，抑制Bax誘導的細胞凋亡。ECH0825還可促進MnSOD(mitochondrial manganese SOD)的表達，抑制ROS(Reactive Oxygen Species)水平，并抑制ROS介導的細胞損傷和凋亡[27]。在感染的不同時期，查菲埃立克體效應子TRPs(Tandem-repeat proteins)與不同的宿主細胞蛋白相互作用，抑制細胞凋亡。TRP120(120-kDa tandem-repeat protein)與宿主細胞蛋白ICAM3(intercellular adhesion molecule 3)結合，激活Akt/ERK/CREB2途徑，抑制細胞凋亡[28]。

5 逃避宿主自噬清除

細胞自噬是真核生物對胞內衰老的細胞器或損傷的蛋白質等的溶酶體降解途徑，降解產物得以循環利用；同時，細胞自噬也在宿主抗病原體感染過程中發揮重要作用[29]，是機體抵抗細菌感染的第2道防線[30-32]。某些細菌(如銅綠假單胞菌、沙門氏菌)誘導的自噬能夠促進機體清除入侵的細菌；而某些細菌(如布魯氏菌)誘導的自噬則有助于其在宿主細胞內的寄生。

Niu等研究[33]發現宿主細胞內嗜吞噬細胞無形體(Anaplasma phagocytophilum)吞噬體上存在自噬標識分子MAP-LC3(microtubule associated protein 1 light chain 3)和 beclin-1。但Cheng等[34]通過質譜和免疫熒光標記分析未能在查菲埃立克體吞噬體上檢測到自噬標識分子，因此推測致病菌可能通過逃避自噬對其殺傷而導致宿主持續感染。Lin等研究[35-36]發現查菲埃立克體通過Ⅳ型分泌系統分泌的效應子Etf-1(Ehrlichia translocated factor-1)與BECN1(beclin-1)、VPS34(catalytic subunit of class Ⅲphosphatidylinositol 3-kinase)、Rab5-GTP相互作用激活PtdIns3K(phosphatidylinositol 3-kinase)，誘導埃立克體自噬體形成；自噬體提供營養物質，促進致病菌生長繁殖。采用3-MA(3-Methyladenine)或spautin-1抑制自噬，或者敲除自噬相關分子ATG5(autophagy-related 5)或BECN1的編碼基因后，致病菌的生長繁殖受到抑制；進一步研究發現查菲埃立克體自噬體具有ATG5、PIK3C3(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3)、PtdIns3P(phosphatidylinositol 3-phosphate)和Rab5分子，但缺乏晚期自噬體標識物LAMP1和溶酶體標識物[35]，提示埃立克體自噬體與溶酶體的融合受到抑制，使其逃逸自噬溶酶體的殺傷而導致持續感染。

6 參與宿主細胞蛋白翻譯后修飾

蛋白質翻譯后修飾(Protein post-translational modifications, PTMs)是蛋白質在翻譯后的化學修飾，是一個復雜的過程，常見的修飾類型有磷酸化、乙?；⒎核鼗?、SUMO化修飾(Small ubiquitin-like modifier)等。查菲埃立克體利用宿主的翻譯后修飾機制促進其在胞內的生存和繁殖，其效應子能夠模擬參與翻譯后修飾的宿主細胞蛋白，去改變宿主蛋白和調控相應的信號通路。

磷酸化的作用位點通常為蛋白上的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基，查菲埃立克體效應子TRPs具有高絲氨酸/蘇氨酸含量，并且具有磷酸化位點。效應子TRP47與Src家族中的參與TCR信號通路的關鍵分子酪氨酸激酶Fyn結合，參與TRP47的酪氨酸磷酸化[37]。SUMO化修飾是一種重要的蛋白質翻譯后修飾方式，有研究[38]證實，查菲埃立克體效應子TRP120的C末端被SUMO化修飾，用高密度微流體肽陣列技術已經確定了SUMO化位點；用小分子抑制劑抑制宿主SUMO通路，可顯著降低TRP120與PCGF5(polycomb group ring finger 5)的相互作用，減少吞噬體上PCGF5聚集，從而抑制其在宿主細胞內生存[39]。查菲埃立克體分泌的效應子TRP120與泛素連接酶E3、KLHL12、FBXW7等分子作用，參與泛素化修飾而逃避宿主的免疫攻擊[28]。

7 激活宿主細胞的Wnt和Notch信號通路

查菲埃立克體通過表面表達或分泌的效應子，調控宿主細胞信號通路。在其感染宿主細胞后，Jak/Stat、p38MAPK、NF-κB信號通路均被抑制，從而逃逸免疫殺傷。然而，查菲埃立克體又可通過激活Wnt和Notch信號通路，促進其胞內存活。

研究[8]證實，查菲埃立克體TRP120與Wnt5a、LRP6(lipoprotein receptor-related protein 6)、Dishevelled(Dvl)等結合，形成Wnt復合物，該復合物激活后，可以抑制下游GSK3 CK1/2蛋白復合物的形成，從而使胞質內的β-catenin穩定存在，并在胞質內聚積；β-catenin去磷酸化并移位至細胞核，與轉錄因子TCF/LEF作用，促進Wnt靶基因表達，從而促進其在細胞內生存。基因敲除Wnt信號通路主要分子(Wnt5a、Fzd5、β-catenin、NFAT)或與TRP相互作用的Wnt信號通路分子(ARID1B、KDM6B、IRF2BP2、PPP3R1、VPS29)，能夠顯著抑制查菲埃立克體感染。

Notch信號通路具有高度保守性，參與調節細胞的分化、增殖和凋亡，并在調節天然和獲得性免疫應答中發揮重要作用。研究表明，查菲埃立克體效應子TRP120可以與Notch信號通路相關基因notch1[40]、非金屬蛋白酶ADAM17[41]、Notch信號通路的重要調節因子NEDD4L和FBXW7[28]相互作用，激活Notch信號通路，促進其在胞內生存。

8 總 結

查菲埃立克體致病機制錯綜復雜，多種效應子參與了它的粘附和入侵宿主細胞、細胞信號轉導、基因轉錄調節等細胞生理過程。其感染宿主細胞后，則通過抑制宿主免疫應答、抑制吞噬體溶酶體融合、抑制宿主細胞凋亡、逃避宿主自噬清除、參與蛋白質翻譯后修飾等多種方式逃逸宿主的免疫攻擊，并促進其持續感染。

利益沖突：無