VIP在肝癌中的表達及與巨噬細胞極化的相關性的研究

王 濤，葛勇勝，劉文斌，束清華，石 旭

肝細胞癌(簡稱肝癌)是消化系統最常見的實體腫瘤之一[1],原發性肝癌患者由于多藥耐藥而預后較差[2]，患者總體復發率達到70%。雖然肝癌的診斷和治療手段不斷提升，但其結果仍不理想，早期對肝癌所形成的認識以及評價重點為以臨床背景作為基礎的配套腫瘤分期(如：BCLC以及TNM分期)。而近些年來腫瘤微環境的概念越來越得到人們的重視，其在腫瘤的預后及評價中發揮重要作用，免疫細胞作為腫瘤微環境的腫瘤組成部分[3]，免疫細胞中的腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage,TAM)被發現起著越來越重要作用。TAM一般可以界定為兩個基礎分類：經典激活的促炎癥M1型，替代性M2型。前期研究[4]表明：M2型巨噬細胞在肝癌患者晚期階段的表達顯著高于M1型巨噬細胞，并且影響其預后。那是什么原因會導致晚期肝癌中M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞表達的差異促使進一步探究。

血管活性肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)是由28個氨基酸組成的多肽，血管活性腸肽具有廣泛的生理作用，涉及各個系統。研究[5]顯示VIP與惡性腫瘤的關系密切,如:一些惡性腫瘤組織中VIP含量增加，能調節TNFα， IL-6,，IL-12和INOS，參與腫瘤的免疫逃逸，其原理可能與巨噬細胞的極化有關。然而，VIP與肝癌的關系鮮有報道，該研究通過該研究通過Western blot 法和實時定量PCR法檢測VIP在肝癌組織和癌旁組織中的表達，同時免疫組化染色檢測肝癌組織和癌旁組織中VIP及巨噬細胞標志物CD68，M1巨噬細胞標記物CD11c以及M2型巨噬細胞標志物CD206的表達，初步探討肝癌組織中VIP的表達及其與巨噬細胞極化的關系。

1 材料與方法

1.1病例資料以安徽省立醫院肝臟外科收治案例作為基礎，選擇2006年4月～2015年10月，進行相關的切除標本資料同時在相關的病理證實中確定歸屬于肝細胞性肝癌的石蠟標本，選擇的標本數量90例，其中男性標本62例，女性28例，TNM分期為Ⅰ/Ⅱ級55例，Ⅲ/Ⅳ級35例。同時選定該院內的肝膽胰實驗室所存放的肝癌以及周邊組織的標本共計20例，針對其開展配套的Western blot以及qRT-PCR的檢驗工作。選擇的案例在手術之前并沒有進行化療、放療以及介入等相關的治療操作；這一分析得到了患者以及家屬的書面認可，同時已經通過了院內倫理學委員會的審批程序。

1.2主要試劑CD11C抗體購自美國abcam公司；VIP抗體、CD206抗體和CD68抗體均購自北京bioss公司；免疫組化試劑盒和β-actin購自北京中杉金橋公司；ECL超敏發光試劑盒、逆轉錄試劑盒購自美國Thermo公司；PCR引物購自上海生工生物工程公司。

1.3實驗方法

1.3.1免疫組化染色 運用免疫組化SP法檢測CD68、CD11c、CD206和VIP蛋白表達，所選肝癌標本來自于醫院病理科，制成2 μm厚切片，過三道二甲苯及乙醇后，經過抗原高溫還原，按1 ∶2 000加入VIP抗體(CD68為1 ∶400，CD206為1 ∶100，CD11c為1 ∶100)，4 ℃ 孵育過夜，加入通用型二抗37 ℃孵育 30 min，PBS洗片后，DAB顯色;隨后蘇木精復染，再經酒精梯度脫水、中性樹膠封片。步驟均參照試劑盒的說明書進行操作，對各分子進行染色。

1.3.2Western blot 取肝癌及癌旁組織100 mg，增添相關的RIPA細胞裂解液1ml，在4 ℃，12 000 r/min條件下離心處理15 min，獲得蛋白，制配SDS-PAGE凝膠， 1 ∶4的比例增添5×SDS-PAGE緩沖液。在沸水狀態下加熱持續10 min，以此來實現充分變性的效果。樣品降低到室溫之后，上樣至SDS-PAGE孔就可以完成。對每孔的劑量為5～20 μl。濃縮膠實際采用的電壓參數是80 V。電泳結束后，分離蛋白并將蛋白至PVDF膜上，將膜放入預制的洗滌液之內，持續漂洗5 min，VIP一抗(抗屬于兔抗1 ∶300稀釋；同時其中采用了10%的分離膠)4 ℃的狀態下低速搖動過夜。1 ∶10 000進行HRP標記二抗的稀釋操作。在室溫環境中持續2 h。增添，洗滌3次。顯影、定影，結果拍照、掃描；同法用兔抗人β-actin作內參對照；VIP條帶灰度值與β-actin灰度值之比用于統計學分析。

1.3.3qRT-PCR 參照TRIzol說明書提取20例冰凍標本中肝癌組織和癌旁組織總RNA，合成 cDNA，PCR擴增條件為: 95 ℃預變性2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，經過40個循環。VIP熒光定量引物序列F:5’-CTTGGGTCAACTTTCTGCCA-3’,R:5’-GGCGG-GTATAGTTGTCAGTG-3’，擴增產物長度131 bp；內參(β-actin)F:5’-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3’,R:5’-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’，擴增產物長度180 bp；VIP mNA的表達量用 2ΔΔCt進行計算。

1.4結果判定免疫組化結果的判讀由兩名經驗豐富的不知患者臨床資料的病理科醫師雙盲讀片。染色評分：棕褐色3分，棕黃色2分，淺黃色1分，著色很弱或未著色為0分。陽性百分率計算：光鏡下隨機觀察5個高倍鏡視野，陽性細胞百分率0～5%為0分，5%～50%為1分，50%～75%為2分，75%～100%為3分。兩者相乘結果為0分的記為陰性(-)，1～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等強度陽性()，9分為強陽性()，+～均判為陽性；兩者相乘結果的分數得分≥4分者即定為高表達，分數<4分者即定為低表達。

2 結果

2.1VIP在肝癌、癌旁及正常肝組織中qRT-PCR的相對表達量檢測結果顯示，肝癌組織中mRNA相對表達水平(1.10±0.48)高于癌旁組織(0.22±0.13)，其差異有統計學意義(t=7.88P<0.01)。見圖1。Western blot 法分析顯示，肝癌組織中 VIP相對含量(0.87±0.20)高于癌旁組織(0.46±1.56)，差異有統計學意義(t=5.57，P<0.01)。見圖2。

2.2免疫組化結果染色結果顯示VIP在肝癌組織及癌旁組織均有表達，表達部位是細胞質，但肝癌組織細胞中陽性表達率為80%(72/90)，明顯高于癌旁組織中的表達表達率29%(26/90)，見圖3。VIP的表達和臨床因素中患者肝硬化、患者年齡相關(χ2=12.63、4.756，P<0.05)，而與肝癌患者的腫瘤包膜、肝癌TNM分期、腫瘤大小等其他臨床病理特征無明顯相關性，見表1。同時結果顯示肝癌組織中VIP的表達與CD68的表達呈正相關性(r=0.443,P<0.05)，見表2；VIP的表達與CD206也呈正相關性(r=0.328,P<0.05)，見表3；而與CD11c呈負相關性(r=-0.309，P<0.05)，見表4。

圖1 qRT-PCR實驗分析VIP在肝癌組織

圖2 肝癌及癌旁組織中VIP蛋白的表達

T:肝癌組織；N:癌旁組織；a、b、c、d ：4組配對的肝癌與癌旁組織

圖3 免疫組化染色檢測各指標在癌和

A:VIP；B：CD68；C：CD206；D：CD11c；1：癌組織；2：癌旁組織

表2 VIP與CD68相關性(n)

表3 VIP與CD206相關性(n)

表4 VIP與CD11c相關性(n)

3 討論

最開始是Said et al[6]在上世紀70年代對豬小腸的研究中報道VIP的，為一類特定形式的堿性多肽，內部構成為28個氨基酸殘基，對其結構進行研究，發現五分之一是螺旋模式，而剩下的結構不存在明顯的規律；人類的VIP基因位于6q24號染色體區域，核苷酸長度為9 kb，該基因包括7個外顯子。其通過外周以及相關神經系統分泌，具備擴張血管、加快腸道運用的功能，屬于是胰泌素/VIP族的一類物質，同樣也是一類關鍵的腦腸肽，在胃腸道等身體的多個組織和器官中均存在，跟消化系統的健康狀況存在著直接的關聯[7]。VIP通過G蛋白藕聯受體(VPAC1、VPAC2、PAC1)同時利用及PI3K渠道，在生物體內發揮著重要的功能。當下研究[8]表明VIP跟免疫性能還有密切的關系。VIP能夠帶動特定細胞出現抑炎因子IL-10，同時對其他類型的因子具備相應的抑制功能。降低共刺激分子B7的表達；VIP治療可抑制腫瘤壞死因子、IL-6、IL-12和誘導型一氧化氮合酶的表達[9]。VIP參與了胃癌、前列腺癌及血液系統惡性腫瘤[10]多種腫瘤的生長。研究[11]表明發VIP誘導的BCL-2家族蛋白磷酸化可通過Ras/MAPK和PKA信號通路在前列腺癌中抑制細胞凋亡，從而達到腫瘤逃逸功能，促進腫瘤生長。研究[12]證實胃癌組織中VIP表達與胃癌組織中炎性細胞內NKG2D、PI3K表達呈負相關性，而NKG2D-PI3K信號轉導通路是腫瘤免疫細胞發揮免疫的重要信號通路。結腸癌患者血漿內的VIP水平為(116±10.14)μg/ml，明顯高于正常健康人的水平(42.44±2.54)μg/ml。結腸癌細胞株Caco-2在分化時，VIP表達的受體是增加的，用碘標記HT29細胞株結腸癌表面的VIP受體，用放射性元素檢測儀檢測，隨即在溶酶體內可檢測到放射性，說明VIP受體是被溶酶體吞噬并分解，3 min后其放射性減少50%左右。同時動物實驗[13]表明，VIP能促進大鼠結腸癌的生長，VIP受體拮抗劑協同結腸癌化療藥物作用于結腸癌模型鼠，能明顯增強療效，說明VIP在結腸癌作用中主要還是起著促進腫瘤生長的方向，而抑制VIP的作用，則能抑制腫瘤的效果。生理情況下VIP隨門靜脈血流進入肝臟，大部分與肝細胞表面的VIPR進入細胞內被溶酶體消化降解 ，肝硬化時肝功能障礙，VIP滅活減少, 其VIP血漿濃度升高，另有動物實驗[14]表明小鼠體內的VIP的表達量是隨著年齡增長而增加的，這和本實驗證明高齡患者組織內VIP表達高于低齡以及肝硬化患者VIP表達較高相一致。

TAM作為生長因子、細胞因子趨化因子等分子的作用靶點，能改變腫瘤微環境，促進腫瘤惡化。M1巨噬細胞型主要能分泌殺傷分子、炎癥因子、趨化因子等參與炎癥反應、清除病原體，還可高提呈抗原，參與免疫應答發揮抗腫瘤效應；M2型巨噬細胞抗原提呈能力較弱，抑制了T細胞增殖，參與了腫瘤的發生、發展及轉移，促進血管和淋巴管生成等。最近的研究[15]表明anti-TAM作用的小分子抑制劑抑制腫瘤生長,如細胞毒性因子、唑來膦酸。然而這些對腫瘤抑制劑表現出低滲透和有限的影響，說明抑制TAM作用主要是要選擇性抑制M2型巨噬細胞而不是M1型巨噬細胞的作用才會達到最佳的效果。本研究中結果顯示VIP與TAM標志物CD68和M2型巨噬細胞標志物CD206的表達呈正相關性，說明VIP可能促進了巨噬細胞向M2型活化，用VIP類似物或受體拮抗劑來抑制TAM的作用將能選擇性的抑制M2巨噬細胞而不會抑制M1型巨噬細胞的作用，將能更好的抑制腫瘤生長。這僅僅是從有限的實驗數據中得到的推論，需要更多的動物實驗和體外細胞實驗進一步證實。