尋常型銀屑病患者皮損中C/EBPβ表達水平的研究

柳莉丹，劉紅芳，吉蘇云，李錦意，張 嬌，王曉華，陳永鋒

銀屑病是一種以紅斑鱗屑為皮膚表現的慢性炎癥免疫性疾病，伴有遺傳傾向，而轉錄及轉錄后水平的研究是銀屑病遺傳背景研究的熱點。CCAAT /增強子結合蛋白(C/EBP)是B-ZIP DNA結合蛋白家族，其作為轉錄因子調節許多細胞類型的生長和分化，包括肝細胞、單核細胞、脂肪細胞、角質形成細胞等[1-2]。C/EBP通過對靶基因轉錄的調節，廣泛參與細胞增殖與分化、炎癥反應、腫瘤的發生與凋亡、肝臟再生等生理過程。

在以角質形成細胞異常增殖和分化的銀屑病中，C/EBPβ如何表達，是否參與了疾病的發生發展過程，目前國內外文獻未有報道。為了探討C/EBPβ與銀屑病的關系，該研究檢測了尋常型銀屑病患者皮損以及對照組正常皮膚中C/EBPβ的分布及表達差異性，并分析C/EBPβ表達水平以及其與病情評價指標的關系。

1 材料與方法

1.1病例資料22例尋常型銀屑病患者均為2016年12月～2017年5月廣東省皮膚病醫院皮膚科門診患者，臨床皮損和病理診斷均符合《臨床皮膚病學》第二版尋常型銀屑病診斷標準。排除標準：① 近3個月接受過系統治療(如糖皮質激素、免疫抑制劑、維A酸藥物等)、光化學治療；② 合并自身免疫性疾病者；③ 影響本研究的其他皮膚疾病(如炎癥性疾病、過敏性疾病、真菌感染性疾病及其他嚴重的慢性系統性疾病)；15例正常對照組為我院整形外科行整形手術者。兩組間性別及年齡匹配。所有入選者簽署知情同意書，研究通過本院醫學倫理委員會審查。

1.2主要試劑和儀器TRIzol試劑(廣州欣勵和生物科技有限公司)；逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)；SYBR Prime Ex TaqTMⅡ均購自日本TaKaRa公司；Anti-C/EBPβ單克隆抗體(美國Abcam公司)；DAKO酶標羊抗鼠/兔IgG抗體(二抗)[基因科技(上海)有限公司]；引物合成及設計(上海生工生物工程股份有限公司)；Leica 2135石蠟病理切片機、Leica病理組織包埋機(德國Leica公司)；顯微鏡(日本olympus公司)；凝膠成像儀(上海天能有限公司);NanoDrop儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司)；PCR儀(美國Bio-Rad公司)；light Cycler 480 PCR儀(瑞士Roche公司)。

1.3方法

1.3.1一般資料及標本收集 收集患者一般資料(性別、年齡、病程、皮損及臨床癥狀等)，評估患者皮損面積和嚴重程度指數，即PASI評分情況。簽署知情同意書后，手術室切除尋常型銀屑病患者(22例)皮損組織及對照組(15例)正常皮膚組織，一半10%福爾馬林液浸泡后石蠟包埋用于免疫組化，一半生理鹽水沖洗后液氮凍存用于PCR檢測。

1.3.2免疫組化染色法檢測 取包埋后的組織修剪邊緣后裝入切片機作4 μm切片，烘箱過夜進行脫蠟，脫蠟后將標本進行阻斷內源性過氧化物酶，PBS液沖洗后將標本架置于pH 9.0抗原修復液中進行修復(置于微波爐中中高火7 min,中底火15 min)，用自來水復溫后取適量Anti-CEBPβ抗體用一抗稀釋液稀釋至合適濃度(稀釋濃度1 ∶100)孵育標本30 min,沖洗后滴加二抗孵育20 min，最后進行DAB顯色，封片后用顯微鏡觀察C/EBPβ蛋白表達及分布(按照抗體說明書及文獻，C/EBPβ陽性表現為胞核出現黃色或棕色的顆粒狀物質沉積)。C/EBPβ蛋白表達水平以平均光密度值(Image pro plus 6.0軟件分析圖像所得)表示。

1.3.3逆轉錄聚合酶聯反應(RT-PCR)檢測 ① 提取組織中總RNA(采用經典TRIzol法，所有操作冰上進行)：取出液氮中保存的實驗標本，稱重后置于研缽研磨組織組織至粉末狀(中途不斷加入液氮)；向組織內加入適量組織裂解液TRIzol(100 mg組織/1 ml TRIzol),充分研磨混勻后將標本收集于1.5 ml無酶EP管中，冰上靜置5 min；向EP管中加入0.2 ml氯仿萃取，劇烈震蕩，冰上靜置5 min后于4 ℃離心機進行離心(12 000 r/min、20 min)，離心后收集上層水相，并加入等體積異丙醇，小心上下混勻6次，進行RNA沉淀；再次將標本置于4 ℃離心機中，離心12 000 r/min、10 min，可見EP管底部出現白色沉淀，即為所提取組織中總RNA；除去上清液，加入預冷的75%乙醇進行沉淀清洗，小心上下混勻，防止RNA降解；清洗后去除液體于超凈工作臺進行風干，最后加入20 μl DEPC水進行RNA溶解，其后用NanoDrop儀檢測RNA濃度，按照逆轉錄試劑盒將RNA逆轉為cDNA,置于-80 ℃冰箱保存或用于實時熒光定量PCR實驗；② 進行實時熒光定量PCR：以GAPDH作為內參，C/EBPβ上游引物：5’-TCTCTGCTTCTCCCTCTGCC-3’，下游引物：5’-ACAGCAACAAGCCCGTAGG-3’ ；GAPDH上游引物：5’-AAGTATGACAACAGCCTCAAG-3’，下游引物：5’- TCCACGATACCAAAGTTGTC-3’；采用20 μl反應體系，在PCR板中分別加入10 μl SYBR Premix Ex Taq、2 μl cDNA 、6.4 μl無RNase水、上下游引物各0.8 μl，實時熒光定量PCR儀上機檢測，軟件讀取C/EBPβ及GAPDH的Ct值；對數據進行相對定量分析，利用所測Ct值，計算C/EBPβ mRNA相對表達量，本實驗中采用2-ΔΔCt相對定量方法對數據進行分析，其中ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

1.3.4相關性分析 按照銀屑病皮損面積及嚴重程度指數(psoriasis area and severity index，PASI)評分標準，記錄患者PASI評分，并進行Pearson相關性分析，評估皮損組織中C/EBPβ平均光密度與PASI評分相關性。

2 結果

2.1實驗對象基本資料分析22例尋常型銀屑病患者中，男13例，女9例；年齡17～78(40.95±16.609)歲；病程3個月～30年，平均(7.7±7.438)年；PASI評分為2.4～18.8分。15例正常對照組，男7例，女8例；年齡19～58(31.33±11.848)歲 。尋常型銀屑病患者與正常對照者在性別(χ2=0.734，P>0.05)、年齡構成上差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2尋常型銀屑病患者與對照組組織中CEBPβ表達及分布免疫組化染色法定位CEBPβ在尋常型銀屑病皮損中廣泛分布于表皮各層細胞胞核，以棘層上部及顆粒層為主，正常對照組則可見CEBPβ強烈表達于表皮各層細胞的胞核(圖1)；CEBPβ平均光密度值(0.204±0.582)低于對照組(0.273±0.439)，差異具有統計學意義(t=-3.894,P<0.001)。見圖2。

2.3尋常型銀屑病與正常對照組組織中CEBPβmRNA表達量RT-PCR方法檢測組織中CEBPβ mRNA表達量，結果表明：尋常型銀屑病患者CEBPβ mRNA(0.48±0.302)表達量低于正常對照組(0.754±0.194)，差異具有統計學意義(t=-3.11，P<0.005)。見圖3。

2.4組織中CEBPβ表達量與患者PASI評分相關性分析22例尋常型銀屑病患者PASI評分為(4.196±0.895)，相關性分析顯示組織中CEBPβ 蛋白的表達與患者PASI評分呈負相關性(r=-0.642,P<0.005)。見圖4。

圖1 銀屑病組與正常對照組中C/EBP β表達

圖2 銀屑病組患者與正常對照組組織中CEBPβ平均光密度值

圖3 銀屑病組患者與正常對照組組織中CEBP β mRNA表達量

3 討論

銀屑病是一種多基因參與的紅斑鱗屑性皮膚病，通過免疫介導的共同通路最后引起角質形成細胞發生增殖的慢性炎癥免疫性疾病。CCAAT增強子結合蛋白(C/EBP)是在肝臟、脂肪組織、血液細胞和內分泌胰腺分化過程中選擇性表達的堿性區域/亮氨酸拉鏈(bZIP)轉錄因子[3]，包括6個家族成員，其中C/EBPβ可參與調控炎性細胞因子IL-α、IL-1β、IL-6、IL-17、IL-36α和INF-γ等的表達[4-6]，而這些細胞因子在銀屑病炎癥反應中起到重要作用。

圖4 銀屑病皮損中C/EBPβ平均光密度值

C/EBPβ也稱作核因子白細胞介素-6(nuclear factor for IL-6，NF-IL6)，由于該基因mRNA有4個轉錄起始點，故該蛋白包括LAP*、LAP和LIP三種主要亞型，其中LAP*、LAP為轉錄激活因子，而LIP為轉錄抑制因子[7]。C/EBPβ在小鼠和人表皮中高度表達在1997年已被提及，House et al[8]發現C/EBPβ豐富的表達于小鼠皮膚、毛囊及皮脂腺中，主要表達在基底層上部的三種角質形成細胞的細胞核內，且比已知表達高水平C/EBP的其他組織中觀察到的水平更高。Zhu et al[9]研究發現在C/EBPβ缺乏的原代角質形成細胞中，早期分化標志角蛋白K1和K10的表達明顯增加，表皮是由角質形成細胞構成的復層鱗狀上皮，表明該轉錄因子在復層鱗狀分化中可能起作用[8]。Oh et al[10]在皮膚癌研究中發現C/EBPβ可參與誘導p53的表達和細胞凋亡，同時Zhu et al[11]在小鼠試驗中，證實C/EBPβ是化學誘導的皮膚乳頭狀瘤形成所必需的。

本研究顯示正常皮膚組織中C/EBPβ均一表達于表皮全層細胞胞核，而銀屑病皮損中C/EBPβ則主要表達在分化的上皮層，表皮分化過程中需要基因參與調控，推測C/EBPβ可能具有參與調控銀屑病表皮異常分化的能力。免疫組化顯示銀屑病組C/EBPβ的蛋白表達水平低于正常對照組，同時RT-PCR亦發現銀屑病皮損中mRNA的表達量與皮損中蛋白表達一致，結合C/EBPβ蛋白在銀屑病及正常對照組均表達于細胞核，以上均提示C/EBPβ可能是在轉錄水平發揮其調控作用。本研究與既往實驗[12- 13]均表明正常表達水平的C/EBPβ是表皮角質形成細胞分化所必須的，其表達水平的下調可能參與了銀屑病角質形成細胞的異常分化，但具體機制仍需進一步驗證。C/EBPβ mRNA及蛋白水平變化均提示在銀屑病表皮的增殖和分化中其可能發揮抑制作用，這可能與C/EBPβ的亞型LIP發揮轉錄抑制作用相關。為進一步研究C/EBPβ與銀屑病的相關性,本研究分析了組織中C/EBPβ蛋白的表達與銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(PASI評分)的相關性，結果顯示其表達與PASI評分呈負相關性，進一步說明了C/EBPβ可能參與銀屑病皮損中角質形成細胞異常增殖的過程，可作為一種反映銀屑病皮損嚴重程度的指標。

綜上所述，本實驗初步證實了C/EBPβ與銀屑病發病存在相關性，為后續研究提供了提供了新的實驗基礎和研究方向。然而C/EBPβ在銀屑病中是否通過調控細胞因子或者炎癥信號通路進而發揮調控作用仍需進一步的研究。