MKP-1在PTSD樣大鼠海馬組織中表達改變

邢文龍，劉超猛，王梅子，朱志慧， 張桂青

創傷后應激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)是經歷異乎尋常的災難性創傷事件所造成，以延遲出現和持續存在為特點的身心障礙。在最新出版的DSM-5中將核心癥狀修改為：與創傷事件有關的創傷性體驗重現、持續性回避與創傷事件有關的刺激、認知與心境方面消極改變和警覺性增高或反應性明顯改變，在創傷后開始出現或加重[1]，但其發病機制復雜，產生各種表現的具體機制需要進一步的研究。絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1)是一種雙特異性蛋白磷酸酶，可以使蘇氨酸或酪氨酸殘基去磷酸化，負向調控MAPK信號通路，從而參與了神經元及突觸可塑性、神經元功能和存活等方面的調節[2]。同時，近期也有研究顯示，MKP-1在抑郁中是一種負性調節蛋白，在抑郁模型的大鼠海馬組織中明顯上升[3]，而且通過注射升高海馬組織中的MKP-1后，大鼠會出現抑郁樣行為[4]。然而在PTSD患者中也會出現認知與心境等方面的消極表現，這是否也與海馬組織中的MKP-1的表達有關。該實驗旨在研究PTSD樣大鼠海馬組織MKP-1 mRNA及蛋白表達與大鼠的行為學改變和認知改變之間的關系，以進一步探討PTSD的發生機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物30只健康清潔級雄性SD大鼠，體質量(180±20)g，由新疆疾病控制動物中心提供。實驗動物的喂養嚴格按照石河子大學動物飼養規定，光照時間控制在12/12 h ，溫度(21±2)℃，適應環境7 d。

1.2主要試劑山羊多克隆抗MKP-1抗體(英國abcam公司)；兔抗山羊二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)；熒光定量PCR試劑盒(德國Qiagen公司)；cDNA合成試劑盒(美國Thermo-fermentas 公司)。

1.3模型制備按照隨機數表法將SD大鼠分為Control組、PTSD 1 d組、PTSD 3 d組、PTSD 7 d組、PTSD 14 d組(每組n=6)。PTSD組均采用2005年日本文部省召開的國際PTSD科學會議確定的SPS模型[5]進行造模,依次通過連續束縛2 h、強迫游泳、乙醚麻醉3個步驟進行模型制備，造模完成后7 d內盡量避免打擾。

1.4曠場實驗于造模后第8、10、14、21天,分別對PTSD 1 d組、PTSD 3 d組、PTSD 7 d組、PTSD 14 d組和Control同一時間段進行曠場試驗。曠場箱為(900 mm×900 mm×500 mm)，箱底部劃分25個16 mm×16 mm格子，將其置于安靜的環境中，避免光線直射，通過紅外攝像機，記錄大鼠5 min的運動軌跡，水平得分(也稱為自主運動)，定義為大鼠水平穿越的方格數，規定大鼠3個或4個爪進入同一記為1分；垂直得分(也稱為探索行為)，定義為以2個后爪支撐身體，2個前爪離開底面，每離開一次就記為1分[6]。通過觀察大鼠的站立次數、跨格次數評判大鼠的行為學指標。

1.5水迷宮實驗分別于9、11、15、22 d對PTSD 1 d組、PTSD 3 d組、PTSD 7 d組、PTSD 14 d組和Control組進行連續5 d的Morris水迷宮實驗測量各組的空間探索能力；在實驗后的第6 天撤掉Morris水迷宮水下站臺，測定大鼠的空間記憶能力。

1.6定量即時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測大鼠海馬組織MKP-1的mRNA水平① 分別于刺激后第15、17、21和28 天，將SD大鼠麻醉后采用斷頭取腦，取出大鼠大腦，迅速剝離獲取海馬組織；② 用TRIzol 法提取海馬組織的總RNA，采用紫外分光光度計(Thermo NanoDrop 2000)測量總RNA的濃度與純度，當260 nm/280 nm在 1.8～2.0范圍內時，按照cDNA合成試劑盒說明書進行逆轉錄；③ MKP-1基因引物設計、合成由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。引物序列為：上游引物：5’-AAGATATGCTCGACGCCTTG-3’,下游引物：5’-GTCTGCCTTGTGGTTGTCCT-3’；β-actin上游引物：5’-CAACCTTCTTGCAGCTCCTC-3’，下游引物：5’-CGGTGTCCCTTCTGAGTGTT-3’；④ 采用熒光定量PCR試劑盒在64孔 ABI Prism7300 序列檢測系統 (美國應用生物系統公司)進行擴增。內參基因與目的基因各重復3次，同時設3個陰性對照，建立總體積為20 μl的反應體系，反應條件為：95 ℃，2 min(1個循環)；95 ℃，5 s ；60 ℃， 30 s(40個循環)，循環結束后得到擴增曲線；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，30 s；60 ℃，15 s后得到溶解曲線。

1.7Westernblot法檢測MKP-1的蛋白表達取大鼠海馬，用研缽研碎，研磨之前用液氮冷卻研缽，在研磨過程中同時滴加液氮，充分研磨后加RIPA裂解液，提取出總蛋白。采用紫外分光光度計測量總蛋白的濃度，配平后取20 μg蛋白上樣，通過12%的SDS-PAGE膠電泳，電轉到PVDF膜，用血清封閉2 h，一抗(1 ∶1 000)4 ℃搖床孵育16 h。TBST溶液洗膜后，上二抗(1 ∶10 000)常溫孵育1 h，TBST再次沖洗后移至暗室進行顯影。蛋白表達通過條帶的灰度值表示。

2 結果

2.1曠場實驗進格次數和直立次數比較PTSD 1 d組、PTSD 3 d組與Control組相比在進格次數和直立次數中差異無統計學意義(P>0.05)，PTSD 7 d、PTSD 14 d組與Control組相比，進格次數減少，直立次數下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2水迷宮定位航行能力比較大鼠在應激后分別于9、11、14、21 d行連續5 d的水迷宮實驗，在第1～3天,PTSD 1 d、PTSD 3 d、PTSD 7 d、PTSD 14 d組與Control組相比上臺潛伏時間比較差異均無統計學意義(P>0.05)；在4、5 d，與PTSD 1 d、PTSD 3 d組與Control組相比差異無統計學意義(P>0.05)，PTSD 7 d、PTSD 14 d組與Control組相比潛伏期時間縮短，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3水迷宮空間探索能力比較在水迷宮實驗的第6天行空間探索能力比較，穿臺潛伏期和穿臺次數與Control組比較，PTSD 1 d、PTSD 3 d組差異無統計學意義(P>0.05)，PTSD 7 d、PTSD 14 d組與Control組相比所需時間延長，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4大鼠海馬組織MKP-1mRNA水平表達PTSD 1 d(0.81±0.17)、PTSD 3 d(1.06±0.39)組與Control組(0.67±0.08)相比大鼠大腦海馬組織的MKP-1 mRNA的表達差異無統計學意義(P>0.05)，PTSD 7 d(2.61±0.65)、PTSD 14 d(2.54±0.76)組與Control組相比MKP-1 mRNA的表達升高，且差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5大鼠海馬組織MKP-1蛋白水平表達Western blot 的實驗結果顯示，PTSD 7 d組、PTSD 14 d組MKP-1蛋白表達較Control組明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

表1 曠場實驗直立次數和進格次數比較

與Control組比較：*P<0.05

表2 水迷宮實驗

與Control組比較：*P<0.05

圖1 大鼠海馬組織MKP-1的表達

1：Control組；2：PTSD 1 d組；3：PTSD 3 d組；4 ：PTSD 7 d組；5：PTSD 14 d組；與Control組比較：*P<0.05

3 討論

PTSD是一種發病機制不清、病情復雜多變，治療效果不理想的一種心身障礙疾病，起初是在戰爭后的士兵中發現的，也成為“戰爭疲勞”，經過對該疾病的進一步認識，發現經歷嚴重威脅個體生命的事件如恐怖襲擊、暴力犯罪和虐待、軍事戰斗、自然災害、嚴重事故等創傷性或危及生命的事件后，也會出現類似表現。根據美國PTSD中心統計的數據來看，在美國PTSD的終生患病率為5%,女性多于男性，女性的患病率約為男性的兩倍，其中PTSD患者中將有30%的人會有長期伴隨癥狀[7]。然而近年來，錯綜復雜的原因引起自然災害與人為災難頻繁發生，這些突發事件對人體生理上的損害可能會在一定時間內痊愈，但是會對人們造成嚴重而持久的心理創傷。因此PTSD越來越成為社會關注的重點[1]，也成為精神病學、心身醫學和臨床心理學的研究重點。SPS刺激制造PTSD樣大鼠模型是目前國際公認的最高仿真模型，已廣泛應用于PTSD機制的研究。在本研究結果中，給予大鼠SPS刺激后PTSD 7 d組、PTSD 14 d組的曠場試驗結果提示大鼠在經受應激后緊張度增高，自主行為減少，探索欲望下降，在Morris水迷宮實驗結果中顯示大鼠空間探索以及定位定航能力均出現下降的情況，這兩個結果提示大鼠在行為、記憶方面出現改變，這與典型的PTSD樣癥狀的特征相吻合[8]。表明本實驗SPS刺激制作創傷后應激障礙模型是可靠的。

MKP-1屬于促分裂原活化蛋白激酶磷酸酶(mitogen-activated protein kinase phosphatases,MKPs)家族，通過去磷酸化作用負向調控MAPK(p38、ERK1/2、JUN)的信號通路，在神經細胞的生長、分化、增殖、凋亡中有著重要作用[9]。Comalada et al[10]研究發現，MKP-1在神經系統的調節中起著重要作用，參與神經系統的中的認知、學習、神經元發育等多個方面。有研究表明，MKP-1使JNK信號傳導通路失活，引起微管結構不穩定，從而影響神經元的軸突發育[11-12]，也可通過磷酸化和泛素化對ERK信號轉導通路進行控制，影響海馬組織軸突的可塑性和長時程增強作用(long-term potentiation，LTP)，而LTP是鞏固記憶的重要機制[13]。也有研究[14-15]顯示 MKP-1 表達上調會通過負向調控 MAPK 信號，引起 NO 生成減少造成腦血流灌注不足，加重腦組織損傷，導致腦神經元細胞凋亡。然而目前國內對MKP-1在PTSD方面研究的報道較少。本實驗從不同時間點對MKP-1進行檢測，研究結果顯示，PTSD 1 d組、PTSD 3 d組中MKP-1 mRNA以及蛋白表達并無明顯改變，而在PTSD 7 d組與PTSD 14 d組的MKP-1 mRNA以及蛋白表達高于Control組，這說明SD大鼠在受到SPS刺激后海馬組織中的MKP-1水平是動態波動的，出現的緊張度增高，自主行為減少，學習記憶能力下降等癥狀也可能與MKP-1水平升高有關。本研究中全部選用雄性SD大鼠，主要是避免雌性鼠在其性周期中因雌激素水平變化對MKP-1的表達產生影響，從而造成結果不準確。