沉默精子相關抗原9對膀胱癌細胞的影響

邢家偉，許長寶，趙興華，趙永立，呂 遠，王紅丹

膀胱癌是一種惡性腫瘤，部分患者可通過手術治療的方法得以控制，但目前對于膀胱癌患者預后復發率高、轉移率高的問題依然缺少高效的控制方法[1]。研究[2]表明，精子相關抗原9(sperm associated antigen 9, SPAG9)在正常機體曲細精管的精子中特異性表達。研究[3-5]顯示，在乳腺癌、宮頸癌、肺癌等組織或血清中表達量均異常，表明SPAG9參與腫瘤的發生、發展。但SPAG9在膀胱癌細胞中的表達量以及具體作用機制的相關研究較為少見。該研究通過檢測SPAG9在膀胱癌細胞中的表達狀況，分析沉默SPAG9在膀胱癌的發生發展中的作用，為其膀胱癌的診斷和臨床治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人膀胱癌細胞系T24、J28、RT4以及人膀胱上皮細胞SV-HUC-1均購自美國模式菌種收集中心(ATCC)。

1.1.2實驗主要試劑及儀器 McCoy’s 5A培養基、DMEM培養基、F12K培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；TRIzol、反轉錄試劑盒購自大連TaKaRa公司；β肌動蛋白(β-actin)抗體、SPAG9抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；膜聯蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)凋亡檢測試劑盒、Matrigel膠購自美國BD公司；噻唑藍(MTT)試劑盒、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國Millipore公司；B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)抗體購自美國Sigma公司；增殖細胞核抗原(poliferating cell nucler antigen, PCNA)抗體、細胞核相關抗原Ki-67(nuclear associated antigen Ki67, Ki-67)抗體購自Cellular Signaling Technology公司；基質金屬蛋白酶-2(matrixmetalloprotease 2, MMP-2)抗體、基質金屬蛋白酶-9(matrixmetalloprotease 9, MMP-9)抗體購自武漢博士德公司;熒光定量PCR儀(LightCycler? 480)購自美國Roche公司；凝膠成像系統(Syngene G:BOX)購自英國SynGene公司。

1.2方法

1.2.1細胞的培養 膀胱癌T24、J28細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，RT4細胞置于含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養基中，膀胱上皮細胞SV-HUC-1置于F12K培養基中，均放入37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中，收集對數期細胞進行后續實驗。

1.2.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測細胞中SPAG9 mRNA的表達量 SPAG9引物在Primer 5.0軟件中進行設計并由上海生工合成，見表1。每孔細胞中加入1 ml TRIzol并置于冰上5 min，提取細胞中總RNA。吸取5 μg細胞總RNA，65 ℃變性10 min，冰浴2 min，根據反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，保存于-20 ℃。根據SYBR Premix Ex Taq試劑盒所示，以cDNA為模板，以β-actin為參照反應條件為94 ℃、 4 min，94 ℃、 30 s，56 ℃ 、30 s，72 ℃、 30 s，40個循環。實驗重復3次，2-ΔΔCt法計算SPAG9的相對表達量。

表1 引物序列

1.2.3Western blot法檢測SPAG9蛋白的表達水平 棄去培養基，加入蛋白裂解液，冰浴5 min，離心，收集上清液，吸取2 μl進行濃度測定，其余蛋白樣品與適量5×上樣緩沖液混合均勻，煮沸5 min；配置適宜濃度的分離膠，吸取40 μg蛋白樣品加入上樣孔中，恒壓為80 V，電泳至蛋白質進入分離膠，調整為恒壓120 V，電泳至蛋白遷移至分離膠底部；恒定電流300 mA轉膜150 min；將PVDF膜浸泡與5%的奶粉溶液中，室溫孵育2 h；加入一抗工作液，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次10 min，加入二抗，37 ℃孵育2 h，TBST漂洗3次，每次10 min，避光，加入ECL發光液，凝膠成像儀中檢測，分析蛋白質灰度值。

1.2.4細胞的轉染 以膀胱癌T24細胞作為后續實驗研究對象，穩定傳代后進行轉染。將膀胱癌T24細胞分為3組：對照組、轉染無義組、siRNA-SPAG9組。轉染前24 h，每孔接種3×105個細胞，轉染前6 h更換為無血清培養基。分別將siRNA和Lipofectamine 2000溶于無血清培養基中，然后混合均勻，室溫孵育10 min，形成復合物；每孔細胞中加入上述復合物，37 ℃培養6 h，更換為完全培養基繼續培養。qRT-PCR和Western blot檢測轉染后細胞中SPAG9 的表達量。

1.2.5MTT檢測細胞的增殖 以每孔5×103個接種，轉染，培養箱中培養48 h后，每孔加入20 μl MTT，37 ℃培養4 h，棄去上清液，每孔加入100 μl DMSO，避光振蕩20 min，檢測細胞在490 nm的吸光值(A490 nm)。

1.2.6流式細胞術檢測凋亡率 取轉染后48 h細胞，無菌磷酸鹽緩沖液清洗，調整細胞濃度為1×105/ml，加入100 μl 1×緩沖液，每孔加入5 μl Annexin V-FITC混勻，室溫孵育15 min，每孔加入5 μl碘化丙啶(propidium iodide, PI)，流式細胞儀檢測凋亡的細胞，計算細胞總的凋亡率。

1.2.7細胞的遷移、侵襲實驗 收集各組細胞，計數，調整為1×105個/ml；將Transwell小室置于24孔細胞培養板中，吸取200 μl細胞懸液加入上層上室內，下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養基，37 ℃培養24 h；棄去上層培養基，擦去上層細胞、Matrigel膠，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色20 min，顯微鏡下隨機取5個區域拍照、計數，每孔設置5個復孔，實驗重復3次，取平均值。在侵襲實驗過程中，按1 ∶8的比例將Matrigel膠與無血清DMEM培養基混勻，取80 μl均勻覆蓋在小室膜中，其余實驗步驟同遷移實驗。

1.2.8Western blot檢測細胞惡性表型相關蛋白的水平 根據1.2.3所示，檢測各組細胞中Bcl-2、Bax、PCAN、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白的水平。

2 結果

2.1SPAG9在膀胱癌以及正常上皮細胞中的表達量SV-HUC-1細胞和膀胱癌T24細胞、J28細胞、RT4細胞的SPAG9 mRNA和蛋白的表達量整體比較差異具有統計學意義(F=63.639,P=0.000;F=73.581,P=0.000)。SPAG9 mRNA的表達量分別為(1.000±0.023)、(6.589±0.741)、(4.865±0.520)、(4.573±0.467)，蛋白的表達量分別為(0.158±0.012)、(0.769±0.068)、(0.524±0.053)、(0.489±0.052)；結果如圖1所示，qRT-PCR實驗結果表明，與膀胱上皮SV-HUC-1細胞比較，SPAG9 mRNA在膀胱癌T24、J28、RT4細胞中的相對表達量顯著增加(P<0.05)；與T24細胞比較，SPAG9 mRNA在J28、RT4細胞中的表達量顯著降低(P<0.05)。Western blot實驗結果亦顯示，SPAG9蛋白在膀胱癌T24、J28、RT4細胞中的相對表達量較SV-HUC-1細胞顯著增加(P<0.05)；與T24細胞比較，SPAG9蛋白在J28、RT4細胞中的表達量顯著降低(P<0.05)。

2.2轉染后T24細胞中SPAG9的表達量結果如圖2所示，對照組、轉染無義組、siRNA-SPAG9組細胞中SPAG9 mRNA、蛋白質水平整體比較差異具有統計學意義(F=271.950,P=0.000;F=92.969,P=0.000)。對照組、轉染無義組、siRNA-SPAG9組細胞中SPAG9 mRNA的表達量分別為(1.003±0.024)、(1.000±0.016)、(0.427±0.053)，SPAG9蛋白水平分別為(0.813±0.074)、(0.798±0.062)、(0.254±0.023)。轉染后，T24細胞中SPAG9 mRNA和蛋白的表達量較對照組顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖1 SPAG9在膀胱癌以及正常上皮細胞中的表達量

與SV-HUC-1細胞比較：*P<0.05；與T24細胞比較：#P<0.05

圖2 轉染后T24細胞中SPAG9的表達量

2.3沉默SPAG9對膀胱癌細胞增殖的影響結果如圖3所示，對照組、轉染無義組、siRNA-SPAG9組細胞在490 nm波長下的吸光值分別為(1.236±0.214)、(1.258±0.223)、(0.567±0.053)。3組細胞在490 nm波長下的吸光值整體比較差異具有統計學意義(F=14.118,P=0.005)；轉染后，T24細胞的增殖較對照組顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.4沉默SPAG9對膀胱癌細胞凋亡的影響結果如圖4所示，對照組、轉染無義組、siRNA-SPAG9組細胞的凋亡率分別為(6.521±0.784)%、(5.872±0.736)%、(17.489±2.553)%。3組細胞的凋亡率整體比較差異具有統計學意義(F=49.974,P=0.000)；轉染siRNA-SPAG9后，T24細胞的凋亡率較對照組顯著增加，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖3 沉默SPAG9 對膀胱癌細胞增殖的影響

2.5沉默SPAG9對膀胱癌細胞侵襲、遷移的影響結果如圖5所示，對照組、轉染無義組、siRNA-SPAG9組遷移細胞數分別為(369.587±23.786)個、(374.586±25.598)個、(153.226±12.147)個；侵襲細胞數分別為(169.557±18.456)個、(158.236±16.745)個、(82.451±9.227)個。3組的遷移細胞和侵襲細胞數分別整體比較差異具有統計學意義(F=105.040,P=0.000;F=28.589,P=0.001)；轉染siRNA-SPAG9后，T24細胞的侵襲、遷移能力較對照組顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.6沉默SPAG9對膀胱癌細胞惡性表型相關蛋白水平的影響結果如圖6、表2所示，以β-actin為參照，對照組、轉染無義組、siRNA-SPAG9組細胞惡性表型相關蛋白具有顯著變化。與對照組比較，siRNA-SPAG9組細胞中PCAN、Ki67、Bcl-2蛋白的表達量顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，Bax蛋白顯著上調(P<0.05)，MMP-2、MMP-9蛋白顯著下調(P<0.05)。

3 討論

據統計，在我國，膀胱癌的發病率居泌尿系統腫瘤的首位，其中男性的發病率高于女性[6]。膀胱癌術后易發生轉移，5年存活率較低，預后較差，治療費用較高，給患者以及社會帶來了沉重的經濟負擔。目前，尋找膀胱癌治療的分子靶向標志物，使其服務于膀胱癌的診斷以及臨床治療具有重要的意義。SPAG9是目前新發現的腫瘤睪丸抗原之一，調控腫瘤癌基因的水平以及細胞的擴增等。早期人們認為SPAG9只特異性表達于睪丸組織中，不表達于正常組織，調控精卵結合的過程。但近年來的研究[7-9]顯示，SPAG9在腫瘤組織或者血清中發揮較強的免疫原性作用。SPAG9通過與多種細胞因子以及蛋白結合，從而激活細胞中的信號通路，調控人體多種生理過程，與機體某些疾病和腫瘤的演進密切相關，因此SPAG9可能是腫瘤生物治療的潛在靶點[10-13]。以人膀胱上皮細胞SV-HUC-1和膀胱癌T24、J28、RT4細胞系作為體外實驗的研究對象，qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，SPAG9在膀胱癌T24、J28、RT4細胞系中的表達量顯著高于膀胱上皮細胞SV-HUC-1，提示SPAG9在膀胱癌的差異表達與膀胱癌細胞的惡化過程密切相關。

圖4 沉默SPAG9 對膀胱癌細胞凋亡的影響

蛋白對照組轉染無義組siRNA-SPAG9組F值P值PCAN0.541±0.0470.568±0.0500.236±0.018?60.7920.010Ki-670.478±0.0390.486±0.0430.216±0.025?53.1700.012Bcl-20.685±0.0630.679±0.0580.241±0.032?69.8250.015Bax0.257±0.0210.263±0.0270.692±0.057?126.7150.008MMP-20.258±0.0260.274±0.0230.124±0.017?40.8760.018MMP-90.341±0.030.336±0.0350.154±0.012?42.6980.009

與對照組比較：*P<0.05

圖5 沉默SPAG9 對膀胱癌細胞侵襲、遷移的影響

圖6 沉默SPAG9 對膀胱癌細胞惡性表型相關蛋白水平的影響

大量研究顯示，探究腫瘤轉移、浸潤的機制，尋找合適的分子靶點，對提高腫瘤患者的5年生存率以及改善預后不良、降低治療費用具有重要的意義。腫瘤細胞的過度增殖是惡性腫瘤發生、發展的重要生物學特征。腫瘤細胞的增殖涉及多種信號因子或者相關信號通路的激活，促進細胞的增殖。SPAG9在多種腫瘤的惡性發展中發揮重要作用。應用siRNA技術，沉默膀胱癌T24細胞中SPAG9的表達后，T24細胞的增殖受到明顯抑制，凋亡率顯著增加，細胞的侵襲、遷移能力顯著降低，表明SPAG9在膀胱癌細胞的惡性生物學特性中發揮重要作用。

大量研究[14]表明，SPAG9與多種腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移密切相關。SPAG9在肺癌組織以及血清中的表達量異常，可作為肺癌診斷的分子標志物。SPAG9可通過降低MMP-9、激活相關信號通路，從而調節肺癌的轉移能力;在前列腺癌中，SPAG9可通過調節細胞周期相關蛋白Cyclin D1、Cyclin E水平，從而對腫瘤細胞產生明顯的抗腫瘤作用[15]。為了研究SPAG9對膀胱癌細胞生物學特性的作用機制，對細胞增殖、細胞凋亡以及侵襲遷移相關蛋白PCAN、Ki-67、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9等進行了檢測，分析沉默SPAG9后，上述蛋白水平的變化。結果顯示，下調膀胱癌細胞中SPAG9基因的表達量，細胞增殖相關蛋白PCAN、Ki-67的表達量降低；與對照組比較，細胞抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達量顯著降低，促凋亡蛋白Bax的水平明顯增加；細胞侵襲、遷移相關蛋白MMP-2、MMP-9的表達量較對照組顯著下調，表明SPAG9可能通過調控細胞惡性表型相關蛋白，從而激活更多的信號轉導通路來發揮其抗腫瘤的作用。

綜上所述，研究顯示，SPAG9在膀胱癌細胞中的表達量上調，表明SPAG9與膀胱癌的發生、發展有關；沉默SPAG9可通過調節細胞惡性表型相關蛋白的表達量，抑制膀胱癌細胞的增殖，促進其凋亡，降低細胞的侵襲、遷移能力，可作為膀胱癌診斷和預后評估的生物學標志以及分子靶向治療的潛在靶點。