熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)體系的構(gòu)建及其驗(yàn)證

錢月嬌，馮鈺斌，錢學(xué)文，朱傳君，李 鴿，盧 多，陳飛虎

熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)，是較早發(fā)展起來(lái)的一門技術(shù)[1]。該技術(shù)是基于兩個(gè)熒光源針對(duì)其空間距離的差異表現(xiàn)出信號(hào)變化的現(xiàn)象而形成的，適用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的各類分子，不破壞研究對(duì)象的活性和空間構(gòu)象，具有高靈敏度和高分辨率，并能夠清晰成像，最直觀地觀察到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的定位及定量信息[2-4]。該研究在大腸桿菌系統(tǒng)構(gòu)建了該體系，且明確了測(cè)量細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外信號(hào)的可行性。已有研究為了證實(shí)距離足夠近可以產(chǎn)生FRET信號(hào)，構(gòu)建過(guò)該體系，但其載體酶切位點(diǎn)較少，重在通過(guò)酶切確定FRET信號(hào)的消失[5-6]。為此該研究選用具有多酶切位點(diǎn)的載體，重在后續(xù)用于具體功能檢測(cè)而構(gòu)建的一個(gè)新體系。由于兩個(gè)熒光源蛋白編碼基因非常相似[7]，在體系構(gòu)建過(guò)程中存在一定的難度。該體系在藥物研究中可以提供對(duì)生物大分子之間相互作用檢測(cè)，進(jìn)一步可以成為靶向分子間相互作用藥物篩選手段。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒與菌株質(zhì)粒pET28a(+)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所實(shí)驗(yàn)室留存；大腸桿菌(E.coli)Trans1-T1、Rosetta(DE3)菌株感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2工具酶及主要試劑DNA模板pEYFP-N1、pECFP-N1購(gòu)自普如汀生物技術(shù)(北京)有限公司；PCR引物和測(cè)序均由睿博興科生物技術(shù)有限公司完成；限制性內(nèi)切酶Nde I、BamH I、Not I、Xho I購(gòu)自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；T4連接酶購(gòu)自NEB(北京)公司；高保真Taq DNA聚合酶、1 000 bp DNA Marker、蛋白質(zhì)標(biāo)志物購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Pure Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Agarose購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司；Agar、Gel Green、YEAST EXTRACT、TRYPTONE購(gòu)自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限公司；IPTG、卡納霉素、氨芐霉素、氯霉素購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；Tris-HCl、咪唑購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；Ni柱、分子篩層析柱購(gòu)自通用電氣公司(GE)；蛋白濃縮管(milipore)購(gòu)自北京希凱創(chuàng)新科技有限公司。

1.3工程質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)已知的ECFP、EYFP的編碼DNA序列設(shè)計(jì)引物，并參考空載pET28a(+)的序列，設(shè)置目的片段的酶切位點(diǎn)Nde I、BamH I以及Not I、Xho I，N端CFP和N端YFP的上下游引物為：5′-GGGAATTCCATATGGTGAGCAA GGGCGAGG-3′，5′-CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC CATGC-3′；C端CFP和C端YFP的上下游引物為5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCGTGAGCAAGGGCGA GG-3′，5′-CCGCTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′。再將pEYFP-N1和pECFP-N1作為DNA模板，分別進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系均為(50 μl)：2×Taq DNA聚合酶反應(yīng)混合液 25 μl，上下游引物(10 μmol/L)各2 μl，DNA模板 0.25 μg，加ddH2O至50 μl。PCR的反應(yīng)過(guò)程均為：① 95.0 ℃預(yù)變性5 min； ② 開(kāi)始進(jìn)行30個(gè)循環(huán)：95.0 ℃變性1 min，(50.0±6.0)℃退火1 min，72.0 ℃延伸30 s；③ 循環(huán)結(jié)束；④ 72.0 ℃終延伸10 min 。DNA瓊脂糖凝膠(1%)電泳分離PCR產(chǎn)物與模板DNA，使用Gel Extraction Kit回收PCR產(chǎn)物，并用紫外分光光度儀測(cè)量其回收后的濃度；再將空載pET28a(+)與膠回收PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行雙酶切處理。N端CFP和N端YFP工程質(zhì)粒構(gòu)建的雙酶切體系為(40 μl)：Green buffer(10×)4 μl、DNA總量為1.8 μg、Nde I 2 μl、BamH I 2 μl、加ddH2O 至40 μl。37 ℃，過(guò)夜。將過(guò)夜雙酶切的質(zhì)粒或PCR產(chǎn)物再分別進(jìn)行切膠回收，測(cè)其濃度。最后將回收的載體與目的片段按一定比例(1 ∶3～1 ∶9)混合，并使用T4連接酶，16 ℃過(guò)夜連接，連接體系為(10 μl)：T4連接酶緩沖液 1 μl，回收的目的片段 + 載體8 μl，T4 DNA連接酶1 μl。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。連接產(chǎn)物與空白對(duì)照組分別轉(zhuǎn)化至Trans1-T1菌株，37 ℃過(guò)夜恒溫孵育。后續(xù)通過(guò)菌落PCR或雙酶切驗(yàn)證初篩陽(yáng)性克隆，最后的結(jié)果以測(cè)序公司的測(cè)序結(jié)果為準(zhǔn)；C端CFP和C端YFP工程質(zhì)粒的構(gòu)建方法同上，只是將PCR反應(yīng)中的上下游引物換成C端的上下游引物，且將限制性內(nèi)切酶換為Not I、Xho I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)。N端CFP和C端YFP融合蛋白工程質(zhì)粒的構(gòu)建，是將構(gòu)建好的N端CFP工程質(zhì)粒和構(gòu)建好的C端YFP工程質(zhì)粒分別用Not I、Xho I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，切膠回收測(cè)其回收產(chǎn)物的濃度，連接轉(zhuǎn)化，測(cè)序確定陽(yáng)性重組克隆；N端YFP和C端CFP融合蛋白工程質(zhì)粒的構(gòu)建，則是將構(gòu)建好的N端YFP工程質(zhì)粒和構(gòu)建好的C端CFP工程質(zhì)粒分別用Nde I、BamH I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，切膠回收測(cè)其回收產(chǎn)物的濃度，連接轉(zhuǎn)化，測(cè)序確定陽(yáng)性重組克隆。

1.4工程蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及其鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)菌株中，挑單個(gè)菌落于加有卡納霉素(終濃度為50 μg/ml)、氯霉素(終濃度34 μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，置于搖床中37 ℃、220 r/min過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。按1 ∶50的轉(zhuǎn)接比轉(zhuǎn)接入新的加有抗生素的LB培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)到OD值為0.6，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，IPTG濃度分別設(shè)為0.1、0.5、1 mmol/L 3個(gè)梯度；溫度分別設(shè)為37、16 ℃；誘導(dǎo)時(shí)間分別設(shè)為37 ℃為2 h、16 ℃則過(guò)夜；同時(shí)設(shè)立未誘導(dǎo)組作為空白對(duì)照。收集誘導(dǎo)的菌液和未誘導(dǎo)的菌液用SDS-PAGE電泳檢測(cè)(菌液離心后放-80 ℃冰箱凍融破碎，未95 ℃加熱變性)，用熒光凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)其熒光，同時(shí)用考馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白條帶位置，確定合適的誘導(dǎo)表達(dá)條件以及鑒定目的蛋白。

1.5重組蛋白的純化配制Ni柱純化緩沖液為A液：500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，甘油5%(v/v)；B液：150 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑(pH 8.0)，甘油5%(v/v)；分子篩純化緩沖液為150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，甘油5%(v/v)。純化步驟：取保存于-80 ℃冰箱誘導(dǎo)表達(dá)的菌沉淀(500 ml菌液離心)至于冰上，讓其慢慢解凍，A、B液中分別按1 ∶100加入PMSF(50 mmol/L)，1 ∶1 000加入芐脒(1 mol/L)(現(xiàn)用現(xiàn)加)，菌沉淀加入A液至5 ml，至冰上超聲破碎2 min，再加入50 μl MgCl2(1 mol/L)，50 μl DNase I(10 mg/ml)，冰上放置30 min，18 000 r/min，4 ℃離心取上清液加入用A液平衡過(guò)的Ni柱(1 ml)中，進(jìn)行純化。純化程序?yàn)椋?的B液洗脫10 ml，10%的B液洗脫至15 ml，每管收集4 ml；而后用100%的B液拉梯度洗脫到22 ml，每管收集0.5 ml；再用100% B液繼續(xù)洗脫到30 ml，每管收集0.5 ml；100% B液洗脫至紫外趨平，每管收集4 ml。根據(jù)出峰位置取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，獲取目的蛋白，觀察蛋白純度，并用蛋白濃縮管濃縮至500 μl。將濃縮后的蛋白進(jìn)一步用分子篩(superdex 200)進(jìn)行分離，同樣根據(jù)出峰位置取樣跑SDS-PAGE膠獲得目的蛋白，并濃縮至200 μl，測(cè)其濃度后分裝保存于-80 ℃冰箱。

1.6FRET體系的驗(yàn)證將純化后的N端CFP、N端YFP、CFP-YFP、YFP-CFP四種蛋白以相同的摩爾濃度(12.7 μmol/L)加到96孔板中，每孔200 μl(1 μl蛋白+199 μl ddH2O)，用酶標(biāo)儀分別在激發(fā)光430、480 nm時(shí)對(duì)發(fā)射光進(jìn)行掃描，并在發(fā)射光510 nm處對(duì)激發(fā)光進(jìn)行掃描，由此確定本實(shí)驗(yàn)所用的黃色熒光蛋白和青色熒光蛋白所對(duì)應(yīng)的的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，以及在波長(zhǎng)430/480 nm和480/530 nm處檢測(cè)其熒光值的變化情況；并平行進(jìn)行了4種蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，將其離心除去LB培養(yǎng)基，以降低酶標(biāo)儀檢測(cè)時(shí)可能的背景值，再以等量T.S.E(10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5, 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA)進(jìn)行重懸，測(cè)其四者菌液的OD值，以相同OD值(1.6)菌液加到96孔板，每孔200 μl，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1目的基因PCR擴(kuò)增及陽(yáng)性克隆鑒定C端CFP和N端CFP目的片段的擴(kuò)增，退火溫度均分別設(shè)為50、55、60 ℃，同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)720 bp的DNA片段，與預(yù)期序列大小均一致，見(jiàn)圖1A。而C端YFP目的片段的擴(kuò)增，退火溫度分別設(shè)為50.5、55.5、60.3 ℃；N端YFP目的片段的擴(kuò)增，退火溫度分別設(shè)為45.5、50.4、55.2 ℃，同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)720 bp的DNA片段，與預(yù)期序列大小均一致，見(jiàn)圖1B。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans1-T1后搖菌提質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在720 bp有電泳條帶的出現(xiàn)，與預(yù)期結(jié)果一致，見(jiàn)圖1C。測(cè)序結(jié)果分別進(jìn)行BLAST比對(duì)和軟件分析后，顯示pNYFP、pCYFP、pNCFP、pCCFP、pYFP-CFP、pCFP-YFP重組質(zhì)粒均構(gòu)建成功，見(jiàn)圖2。

2.2小量誘導(dǎo)表達(dá)與目的蛋白的鑒定YFP-CFP蛋白和CFP蛋白同時(shí)在37 ℃，2 h，IPTG分別為0.1、0.5、1 mmol/L以及在16 ℃，過(guò)夜，IPTG分別為0.1、0.5、1 mmol/L的條件下進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)后，同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，熒光凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)其熒光顯示IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的適宜條件：CFP蛋白16 ℃，過(guò)夜表達(dá)；YFP-CFP蛋白37 ℃，2 h，均對(duì)IPTG在3個(gè)濃度時(shí)沒(méi)有明顯區(qū)別，且YFP-CFP蛋白熒光的位置明顯高于CFP蛋白熒光的位置，符合兩者的蛋白大小，見(jiàn)圖3A。本實(shí)驗(yàn)所誘導(dǎo)蛋白均采用IPTG 0.1 mmol/L，16 ℃過(guò)夜表達(dá)。考馬斯亮藍(lán)染色后，可見(jiàn)CFP蛋白在25～35 ku之間，YFP-CFP蛋白在60～75 ku之間，與目的蛋白大小保持一致，且空白對(duì)照組沒(méi)有目的蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖3B。

2.3蛋白純化蛋白(以CFP為例)經(jīng)過(guò)Ni柱純化顯示，從咪唑濃度為65 mmol/L左右的洗脫液中初步分離得到目的蛋白，蛋白大小在25～35 ku之間，與預(yù)期蛋白大小一致。分子篩層析分離結(jié)果顯示得到了較純的目的蛋白，見(jiàn)圖4。

圖1 目的基因PCR擴(kuò)增及菌落PCR驗(yàn)證

M：1 000 bp DNA Marker；A：1～3：C端CFP目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果；4～6：N端CFP目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果；B：1～3：C端YFP目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果；4～6：N端YFP目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果；C：N端CFP、YFP，C端CFP、YFP重組質(zhì)粒菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果；1：沒(méi)有加樣；2：陽(yáng)性對(duì)照；3：陰性對(duì)照；4：pNCFP；5：pNYFP；6：pCCFP；7：pCYFP

2.4FRET體系的驗(yàn)證分別在蛋白條件下和菌液條件下進(jìn)行了驗(yàn)證。首先在蛋白條件下，酶標(biāo)儀檢測(cè)FRET信號(hào)：4種蛋白以相同摩爾濃度分別加到96孔板中，在激發(fā)波長(zhǎng)為430 nm下，對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)在450～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，而后將數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理繪制成圖，見(jiàn)圖5，可以檢測(cè)到CFP在480 nm處有最大峰值，且在510 nm處伴隨有肩峰的存在，而YFP在530 nm處有最大峰值，同時(shí)對(duì)其激發(fā)波長(zhǎng)在480 nm時(shí)，對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)在500～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，并將數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理繪制成圖，見(jiàn)圖6，可以看到CFP隨著波長(zhǎng)的增大，逐漸降低，YFP在530 nm處熒光值達(dá)到最高峰值，表明該實(shí)驗(yàn)所用的CFP最適激發(fā)波長(zhǎng)為430 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為480 nm和510nm，而YFP最適激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm。同時(shí)在發(fā)射波長(zhǎng)510 nm處，對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)在400～490 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，見(jiàn)圖7。綜合三圖，構(gòu)建的YFP-CFP或CFP-YFP融合蛋白較單獨(dú)存在的YFP和CFP而言，可以很明顯地看到黃色熒光大幅度上升，而青色熒光蛋白大幅度減少，即FRET體系構(gòu)建成功。同時(shí)將其用酶標(biāo)儀在430/530 nm和430/480 nm處進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果與酶標(biāo)儀掃描結(jié)果一致，見(jiàn)表1。其次在菌液條件下，酶標(biāo)儀檢測(cè)FRET信號(hào)：雖然熒光值明顯降低，且FRET現(xiàn)象不如蛋白條件下的更加明顯，但依舊可以較為清晰地看到FRET現(xiàn)象的產(chǎn)生，且可以看到陰性對(duì)照組YFP+CFP無(wú)FRET現(xiàn)象產(chǎn)生，與預(yù)期結(jié)果保持一致，見(jiàn)表2。

圖2 測(cè)序結(jié)果BLAST比對(duì)及軟件分析A：pNCFP；B：pCCFP；C：pNYFP；D：pCYFP；E：pCFP-YFP；F：pYFP-CFP

圖3 SDS-PAGE檢測(cè)IPTG小量誘導(dǎo)表達(dá)情況

M:Marker;A：熒光凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)熒光結(jié)果；B：考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果；1～7：YFP-CFP蛋白的表達(dá)結(jié)果；M：Marker；7：空白對(duì)照，16 ℃，未加IPTG，過(guò)夜；8～14:CFP蛋白的表達(dá)結(jié)果；14：空白對(duì)照，16 ℃，未加IPTG，過(guò)夜

圖4 蛋白純化的峰圖以及SDS-PAGE電泳檢測(cè)的結(jié)果圖

A：CFP蛋白過(guò)Ni柱的峰圖，橫坐標(biāo)是洗脫體積(ml)，縱坐標(biāo)是響應(yīng)值(mAU)；B：CFP蛋白過(guò)Ni柱后SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果；M：Marker；1～12：過(guò)Ni柱后的洗脫樣品；C：粗制備的CFP蛋白進(jìn)一步過(guò)分子篩的峰圖，橫坐標(biāo)是洗脫體積(ml)，縱坐標(biāo)是響應(yīng)值(mAU)；D：粗制備的CFP蛋白過(guò)分子篩后SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果；M：Marker；1～10：過(guò)分子篩后的洗脫樣品

表1 酶標(biāo)儀同時(shí)對(duì)黃色熒光蛋白和青色熒光蛋白進(jìn)行檢測(cè)

圖5 激發(fā)波長(zhǎng)430 nm時(shí)對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)在450～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描A：CFP蛋白；B：YFP蛋白；C：CFP-YFP融合蛋白；D：YFP-CFP融合蛋白

圖6 激發(fā)波長(zhǎng)480 nm時(shí)對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)在500～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描A：CFP蛋白；B：YFP蛋白；C：CFP-YFP融合蛋白；D：YFP-CFP融合蛋白

圖7 發(fā)射波長(zhǎng)510 nm時(shí)對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)在400～490 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描A：CFP蛋白；B：YFP蛋白；C：CFP-YFP融合蛋白；D：YFP-CFP融合蛋白

表2 酶標(biāo)儀同時(shí)對(duì)黃色熒光蛋白和青色熒光蛋白進(jìn)行檢測(cè)

3 討論

本課題旨在建立一種行之有效的FRET體系，成功構(gòu)建了YFP-CFP、CFP-YFP作為陽(yáng)性對(duì)照，YFP+CFP作為FRET體系的陰性對(duì)照。然后對(duì)其進(jìn)行了充分的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，不僅對(duì)其在蛋白條件下進(jìn)行了驗(yàn)證，且在菌液條件下進(jìn)行了驗(yàn)證，酶標(biāo)儀結(jié)果均顯示青色熒光大幅度減弱，黃色熒光大幅度增強(qiáng)，即FRET現(xiàn)象的產(chǎn)生，為相關(guān)研究者提供了詳細(xì)而全面的protocol，但由于雜蛋白的影響，致使菌液條件下的現(xiàn)象不如蛋白條件下的現(xiàn)象明顯。

隨著蛋白質(zhì)間相互作用逐漸成長(zhǎng)為一類新興的藥物靶點(diǎn)，快捷簡(jiǎn)便的功能檢測(cè)方法勢(shì)必會(huì)有益于藥物研究的推進(jìn)。當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室一般比較常用的檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用的方法包括酵母雙雜交、噬菌體展示、免疫共沉淀、等溫滴定量熱、表面等離子共振、熱泳動(dòng)以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移等技術(shù)[8-9]。各種技術(shù)比較起來(lái)，熒光信號(hào)屬于一種比較靈敏且易于觀察的報(bào)告形式，配之以生長(zhǎng)周期短、遺傳背景比較清楚、基因操作方法比較成熟的大腸桿菌異源表達(dá)體系，有利于快速形成一個(gè)適用于多種蛋白質(zhì)間相互作用的檢測(cè)方法[10]。誠(chéng)然，大腸桿菌體系不能表達(dá)所有異源蛋白質(zhì)，可能面臨表達(dá)水平低、蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤、修飾欠缺等多種問(wèn)題，但是這并不能也從來(lái)沒(méi)有阻礙其成為一個(gè)廣泛應(yīng)用的異源蛋白表達(dá)體系。同時(shí)，大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，具有兩層細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，可能在藥物篩選中有利于對(duì)藥物遞送能力的檢測(cè)。同樣使用熒光信號(hào)檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用的方法還有熒光偏振技術(shù)，但是該技術(shù)要求熒光標(biāo)記分子的分子量不能太大，以避免對(duì)其偏振能力造成較大的影響，因此與熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)相比有更多的局限性。

總之，F(xiàn)RET技術(shù)的應(yīng)用訖今為止非常的廣泛，也是目前研究蛋白-蛋白相互作用中非常有價(jià)值和發(fā)展?jié)摿Φ囊环N研究方法。今后的目標(biāo)主要是以活體細(xì)胞和動(dòng)物作為載體，在其生理?xiàng)l件下實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地闡明分子間的相互作用規(guī)律和分子內(nèi)的構(gòu)象變化，加深對(duì)生命活動(dòng)基本規(guī)律的認(rèn)識(shí)。另外與轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)的結(jié)合，將其應(yīng)用到細(xì)胞分子水平的高通量藥物篩選中去，也十分具有發(fā)展前景[11]。隨著FRET技術(shù)應(yīng)用及其研究的不斷深入，必將對(duì)現(xiàn)代生命科學(xué)研究的發(fā)展起著重大的推動(dòng)作用。