NOD樣受體蛋白亞家族在非酒精性脂肪性肝病發生和進展中的作用

孫鮮策

(大連醫科大學 公共衛生學院 勞動衛生與環境衛生學教研室，遼寧 大連 116044)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是代謝綜合征的主要表現之一[1-2]，是肝臟相關疾病與死亡的主要因素[3]。在中國，NAFLD的患病率為15%～30%[4]，接近于歐洲的患病率20%～30%[5]，與日本和新加坡等亞洲國家相比，我國的患病率也處于較高的水平[6]。隨著經濟的發展和人們生活水平的提高，NAFLD的發病率不斷升高，已經成為國內外的公共健康問題，嚴重影響著人們的健康及生活質量。NAFLD的發病與高脂血癥、胰島素抵抗(insulin resistance，IR)、肥胖、高血壓、2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)及心血管疾病密切相關。之前認為非酒精性脂肪肝是代謝綜合征的一個表現，而最近研究發現 NAFLD是T2D和代謝綜合征的先決條件。

NAFLD的發生發展機制一直是近年來的研究熱點。目前，肝臟炎癥反應被認為是促進NAFLD疾病進展的重要原因和關鍵事件。人體自身固有免疫機制是機體的第一道屏障，NOD樣受體蛋白亞家族(NOD-like receptor proteins，NLRPs)參與了機體的固有免疫反應，在人體自身炎癥免疫應答中起重要作用，各類NLRPs炎癥小體與多種代謝性疾病相關，包括NAFLD/NASH[7-11]。本文對NLRPs炎癥小體與NAFLD之間關系的研究現狀及進展進行綜述。

1 非酒精性脂肪性肝病的發生和進展過程

1.1 非酒精性脂肪肝概況

NAFLD是一系列肝臟疾病的統稱，其疾病范圍譜較廣，包括單純脂肪變性(steatosis)，脂肪浸潤加炎癥(lobular inflammation)和肝細胞氣球樣變性(ballooning)，甚至進展至纖維化(fibrosis)，最終導致肝硬化(cirrhosis)，影響著肝臟及多個肝臟外圍組織及調控性通路[12]。一般認為，肝臟細胞中大泡型脂肪變性(macrovascular steatosis)比例>5%，并且沒有酒精、病毒、藥物等其他能夠引起脂肪肝的誘因存在，即定義為NAFLD。而顯著的肝臟脂肪蓄積是疾病進展的重要危險因素。絕大多數的 NAFLD 患者沒有明顯臨床癥狀，大約有30%～40%的NAFLD會進一步發展成為非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，其中40%～50%的NASH會有肝臟纖維化的發生[13]。

NASH是由肝臟中過多的脂質積聚引起的慢性肝損傷和炎癥的病癥。有人將NASH看作整個NAFLD疾病進展的中間環節，因為其既有脂肪變性和炎癥，亦有肝纖維化和硬化所需要的膠原基質沉積。NASH的組織學診斷標準包括脂肪變性，肝細胞氣球樣變和小葉炎癥[14]。肝細胞氣球樣變是指肝細胞增大、腫脹、細胞質稀疏，具有網狀外觀或含有Mallory-Denk體。小葉炎性通常由淋巴細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞組成。門靜脈炎癥在NASH病人中有不同程度地發生，疾病嚴重程度與活組織檢查評分的嚴重程度和IR的血清學特征相關。

1.2 二次打擊學說

NAFLD的發生發展機制較為復雜，目前學界說法不一，占主導地位的是Day于1998年提出的“二次打擊”學說。與肝臟脂質堆積相關的IR為“第一次打擊”，脂肪堆積可以使NAFLD患者產生肝臟及周圍器官的IR，從而形成惡性循環。肝臟IR需要多種炎癥通路以及促炎性細胞因子的參與，包括NF-κB相關信號通路[15-16]及TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子[17]，這些炎癥細胞因子可以介導內源性免疫應答的產生[18-19]。而炎癥是NASH的重要標記[20]，“第二次打擊”為IR發生之后的氧化應激反應，是在首次打擊的基礎上，由活性氧誘導的發生在肝臟實質細胞內的炎癥反應[21]，從而加速NAFLD向NASH進展，甚至引起纖維化。近年來也有學者提出“四次打擊”的學說，即在二次打擊的基礎上，機體對受損的肝細胞進行修復，發生“第三次打擊”，即肝纖維化，進而肝臟微循環障礙，組織細胞缺血壞死，肝小葉重建，最終導致肝硬化，即“第四次打擊”[22]。

由此可知，炎癥應答是NAFLD疾病進展的關鍵節點，起到承前啟后的作用。而炎癥應答的產生及其發揮作用的分子機制，目前仍不明確。

2 NOD樣受體蛋白亞家族與細胞焦亡

2.1 NOD樣受體蛋白亞家族的分類

危險相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)和病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)可以激活大量的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)導致炎癥的發生[23]，NOD樣受體蛋白(nucleotide oligomerization domain-like receptor proteins，NLRPs)作為一種新型的PRRs，可以識別DAMPs和PAMPs[20]，其與適配器蛋白——凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)以及半胱天冬氨酸蛋白酶原(procaspase-1)結合形成的蛋白復合體，稱為炎癥小體(inflammasome)，剪切活化pro-caspase-1產生p10/p20片段，促進IL-1β和IL-18的成熟，誘導炎癥反應[24]。NLRPs炎癥小體激活所介導的炎癥應答在NAFLD疾病進展中的作用越來越受到關注[25]。

目前，在人體中一共發現了22種炎癥體[26]，常見的包括NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP6、NLRP10和NLRP12等[27]。不同類型的NLRPs的激活組裝形式不盡相同，所起到作用也不盡相同。

2.1.1 NLRP1

NLRP1是首先被發現的炎癥小體，可直接與caspase-1結合，并不依賴于ASC，但在ASC存在情況下，會增強NLRP1炎癥體的活性[28]。與其他炎癥小體不同，NLRP1炎癥小體可以定位在細胞核[29]。人類具有單個NLRP1基因，而小鼠具有Nlrp1a，Nlrp1b和Nlrp1c基因[30]。人NLRP1與其鼠直向同源物之間的重要差異在于后者在N末端缺乏PYD基序。Nlrp1b炎性小體是抗炭疽桿菌的重要防御機制，因為Nlrp1b炎性小體激活的缺陷，阻礙感染了活炭疽芽孢桿菌孢子的小鼠的宿主防御。Nlrp1b在小鼠品系之間是高度多態性的。來自129S1小鼠的巨噬細胞產生功能性Nlrp1b，但缺乏其他兩種同種型的mRNA表達。相反，C57BL/6小鼠表達Nlrp1a和Nlrp1c，但在Nlrp1b中具有突變，這使得Nlrp1b蛋白無功能。Nlrp1c的作用仍有待發現，但遺傳數據支持Nlrp1a和Nlrp1b的炎性體信號傳導作用。

2.1.2 NLRP2

NLRP2炎癥小體是由Minkiewicz等[31]在2012年發現的，可以被ATP所激活，并促進炎性caspase-1及IL-1β的加工。其在不同組織中和不同疾病中的作用尚不清楚，需進一步研究。

2.1.3 NLRP3

NLRP3炎癥小體是目前研究最深入最廣泛的炎癥體，其結構包括NLRP3、ASC和caspase-1。NLRP3炎癥小體能被多種分子、細菌和病毒所激活[32]，產生活化的caspase-1片段，促進成熟的IL-1β和IL-18的釋放，誘發細胞焦亡(pyroptosis)[33]。我們課題組研究發現，三氧化二砷或亞砷酸鈉暴露，可以激活肝細胞、肝星狀細胞和胰島β細胞中的NLRP3炎癥小體激活，引發細胞炎癥反應。另外我們已經證實，NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應，在三氧化二砷所導致的NASH中起到至關重要的作用[34]。也有人提出，NLRP3去泛素化是炎性體組裝和活化所必需的。提出K63特異性去泛素化蛋白酶BRCC3在該步驟中從NLRP3富含亮氨酸的重復(LRR)基序去除泛素鏈。這是否會引發NLRP3重定位，誘導構象變化，或用于促進NLRP3炎性體組裝的其他目的尚不清楚。另外，在基礎狀態下修飾NLRP3的E3泛素連接酶的具體作用機制尚不清楚[30]。目前，NLRP3炎癥小體已經成為代謝綜合征等疾病的治療靶向[35]，尋找其上游共同受體，闡明NLRP3活化的具體機制，已經成為研究NLRP3炎癥體的重要課題。

2.1.4 NLRP6

NLRP6炎癥小體在腸道組織中表達較高[28]，參與調節腸道以及內環境菌群穩態。因此，一般認為NLRP6是NLRPs炎癥小體家族中特異性調控腸道炎癥的一類炎癥體[36]。也有研究發現，NLRP6信號在不同的細胞類型可能扮演不同的角色，包括NLRP6調控炎癥小體依賴及非依賴功能通路[37]。

2.1.5 NLRP10

NLRP10是NLRPs家族中唯一不含LRR結構域的成員[27]，NLRP10并不通過形成炎癥小體調控caspase-1而發揮作用。因此，認為其可以負性調控其他炎癥小體[38]。此外，Lautz等[39]發現NLRP10與NOD1信號通路下游的RIP2，TAK1以及NEMO作用，作為NOD10炎癥體活化的適配蛋白，通過影響p38和NF-κB的活化促進由Shigella flexneri誘導的免疫應答。

2.1.6 NLRP12

NLRP12可以與ASC相關聯，形成活化IL-1β成熟炎癥小體[40]。實驗結果證實，NLRP12缺失的小鼠NF-κB和ERK1/2活化明顯增強，導致前炎癥因子的過度表達，另外，可以通過促進Traf3降解，活化NIK和非經典的NF-κB通路，同時增強癌癥相關基因如CXCL12和CXCL13的表達，促進結腸炎癥以及腫瘤的發生[41-42]。因此，認為NLRP12是炎癥反應的負向調節因子。

2.2 NLRPs炎癥小體與細胞焦亡

一般情況下，炎癥小體激活后會引發一種有別于自噬性損傷或細胞凋亡的另一種炎癥性程序細胞死亡，即細胞焦亡。細胞焦亡發生時，一方面細胞膜上會產生分散的大小不一的離子滲透孔，引發水分流入及細胞腫脹。同時細胞內炎癥小體激活使得caspase-1被剪切活化成p20/p10片段，進而促進IL-1β/IL-18的剪切成熟，并向胞外釋放[43]；另一方面，caspase-1 p20/p10切割消皮素D(gasdermin D，GSDMD)，使其N、C兩端的結構域分開，釋放N端片段。GSDMD蛋白N端片段可以識別并結合細胞膜上的磷脂類分子，并進一步在細胞膜上形成孔洞，導致細胞滲透壓變化，最終使得細胞膜裂解，導致細胞焦亡的發生(圖1)[44]。

2.3 細胞焦亡與炎癥反應

研究表明，NLRP3等炎癥小體激活與組織炎癥應答密切相關，抑制NLRP3炎癥小體可以有效緩解組織炎癥反應[26, 43, 45-48]。事實上，炎癥小體激活所導致的細胞焦亡過程中，成熟的IL-1β的釋放所引發的“瀑布樣炎癥反應”，是其引發組織炎癥應答的更重要的原因。由上一部分內容我們可以明確，細胞焦亡的發生依賴于caspase-1的活化，而活化的caspase-1的一個重要功能就是介導IL-1β前體裂解成具有活性的IL-1β。IL-1β是一種強有力的內生致熱源，會刺激機體發熱，白細胞趨化遷移，并表達產生更多種類的細胞因子，這些變化都體現了炎癥的發生。另外，IL-1β和IL-18在一系列炎癥性和自身免疫性疾病的發生機理中都起到十分重要的作用。IL-18主要促進γ干擾素(interferon-γ，IFNγ)的產生，以及T細胞、巨噬細胞的活化；IL-1β能募集、激活其他免疫細胞、IL-6等炎癥性因子、粘附分子等的合成，最終形成級聯反應，增強炎癥應答，引發更為強烈的炎癥反應[49]。同時，還有研究表明IL-1β、IL-6和IL-18具有明顯的致炎作用。IL-1β作為炎癥放大的啟動因子，是炎癥反應的主要參與者。IL-6可通過調控粘附因子的合成及誘導單核細胞趨化蛋白促進其他細胞因子的釋放如IL-1、TNF-α的分泌，這些因子又可以反過來增加IL-6的表達，形成炎癥因子的“瀑布樣反應”[50]。

圖1 細胞焦亡與其他幾種細胞死亡的區別[44]Fig 1 Difference between pyroptosis and others cell death[44]

3 NLRPs炎癥小體與NAFLD疾病進展

近年來研究發現，炎癥反應作為上游胰島素抵抗/脂肪變性和下游細胞損傷的中心環節，在NAFLD疾病進展中起到至關重要的作用[23]，特別是NLRPs作為重要的參與者，在NAFLD的疾病進展當中起到至關重要的作用[51]。

3.1 NLRPs炎癥小體與NAFLD/NASH

單純的良性脂肪變性或輕度NAFLD進展為NASH的關鍵節點，就是慢性炎癥應答的產生。研究者在飲食誘導的NASH小鼠模型中觀察到了IL-1β基因和蛋白表達水平的升高[52]，NLRP3敲除后，可以改善NAFLD的肝功能[53]。另外，在人NAFLD及2型糖尿病病人體內發現了NLRP3炎癥小體mRNA水平的增加[54]。在NASH疾病進展中，DNA、飽和脂肪酸及LPS等均可激活炎癥小體。飽和脂肪酸可以誘導NLRP3-ASC炎癥小體的激活，活化caspase-1，使IL-1β和IL-18成熟，自噬體和線粒體活性氧也參與其中[55-56]。有研究發現，NLRP3炎癥小體的激活參與NASH的肝細胞焦亡、炎癥以及纖維化發生當中[43, 57]，而NLRP3，ASC或caspase-1缺失的小鼠表現出體重增加量及脂肪含量的減少[58]。我們課題組目前研究也證實，在三氧化二砷導致小鼠NAFLD當中，自噬水平上調，自噬溶酶體降解將組織蛋白酶B(cathepsin B，CTSB)釋放到胞漿當中，激活NLRP3炎癥小體，引發細胞焦亡及炎癥反應[34]。當然，也有完全相反的研究結果表明，ASC敲除小鼠更容易發生脂肪變性，肥胖甚至葡萄糖耐量受損[59]，研究者認為，這種差異是由于腸道微生態的改變所造成的。

3.2 NLRPs炎癥小體相關菌群改變與NAFLD/NASH

近年來有學者提出，腸道菌群的改變可以影響NAFLD的疾病進展[60]。腸道微生物群破壞(生態失調)誘導的炎癥可能有助于改變腸道的屏障功能和細菌移位。最近的證據表明，炎癥小體是這一過程的核心，通過調節腸道微生物群從而調節由微生物群驅動的NAFLD表型。炎癥小體是外源性PAMPs和DAMPs的傳感器，其調節caspase-1介導對炎性細胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18的前體的切割。NLRP3和NLRP6炎癥小體敲除后，小鼠體內普雷沃菌科(Prevotellaceae)和細菌科TM7等主要成分顯著增加，進而促進NAFLD疾病進展。

Henao-Mejia等[59]研究發現，NLRP3炎癥小體可以與腸道菌群發生交互作用。研究者發現，4周齡的NAFLD和NASH模型小鼠敲除NLRP3炎癥小體復合物及IL-18后，肝臟炎癥及脂肪變性水平顯著增加。并且將基因敲除鼠與野生型小鼠共同飼養后，野生型小鼠出現了相同的表型，表明炎癥小體缺失的小鼠存在可傳染性腸道菌群的表型，造成飲食誘導性肝臟疾病的風險增強。另外，NLRP6炎癥小體缺失小鼠，腸道菌群與宿主之間的交互作用發生改變，發生脂肪變性向NASH的過渡[60]。另有研究表明，NLRP6或ASC缺陷型大鼠，經硫酸葡聚糖(DSS)誘導后，結腸上皮細胞IL-18水平降低，出現自發性結腸增生，招募炎性細胞聚集。與野生型DSS誘導的大鼠相比，缺陷型大鼠有更為嚴重的結腸炎性反應[61]。炎癥性腸病會大大提高NASH的發生率，而通過抗TNF-α治療可減少NASH的發生率[62]。抗生素治療均可降低炎性小體缺陷小鼠NASH的嚴重程度，并消除對野生型小鼠的傳染性表型效應。因此，生態失調可誘發結腸炎癥和細菌移位，影響從肝臟脂肪變性到NASH的進展。肝臟炎癥小體可能在維持宿主腸道微生態與NASH相關炎癥調控之前的穩態當中起關鍵性作用。

3.3 NLRPs炎癥小體與胰島素抵抗

研究表明，IL-1β阻斷可以作為代謝疾病的治療方案[26]。實際上，有臨床研究報道了IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)或IL-1β抗體在治療T2D中的保護作用。在一項涉及70名T2D患者的雙盲平行組試驗中，IL-1受體拮抗劑Anakinra改善了血糖和β細胞分泌功能，并減少了全身炎癥標志物。另一項研究報道，單次注射抗IL-1β抗體可以改善胰島素分泌。總之，臨床和實驗結果均表明IL-1β損害胰島素信號傳導并誘導胰島素抗性的發展和/或維持。而格列本脲，一種廣泛使用的T2D藥物，抑制NLRP3炎性體介導的caspase-1活化和IL-1β/IL-18分泌，提高了IL-1β抑制，可能有助于格列本脲的抗糖尿病作用。

盡管科學家們對IL-1β在代謝疾病中的作用進行了廣泛的研究，但在代謝應激條件下產生和釋放IL-1β的機制仍然未知。最近的兩項研究報道，高水平的葡萄糖[63]和胰島淀粉樣蛋白多肽(IAPP)[64]是IL-1β產生和NLRP3炎性體激活的關鍵誘導物。前者表明高水平的葡萄糖誘導ROS產生，其隨后通過介導NLRP3和TXNIP在β細胞中的直接結合來激活NLRP3炎性體。后者報道葡萄糖和TXNIP均不介導NLRP3炎性小體的激活和IL-1β加工。相反，他們發現IAPP誘導NLRP3炎性體激活和IL-1β成熟。IAPP是一種與胰島素一起分泌的激素，沉積在T2D患者的胰島間質中。眾所周知，IAPP對β細胞具有細胞毒作用，并誘導細胞功能障礙和細胞凋亡。這些研究成果，提供了NLRP3炎性體和T2D之間聯系新的機制見解。

3.4 NLRPs炎癥小體與肝纖維化

研究表明，在纖維化或局部缺血的創傷性損傷期間，一系列的NLRP3激動劑被釋放出來[26]。Riteau等[65]利用博萊霉素誘導的小鼠肺損傷來模擬人類的肺纖維化，證實了該途徑在氣道炎癥和組織重塑中的作用。此外，患有特發性肺纖維化的患者的支氣管肺泡灌洗液含有高水平的ATP，為人類疾病提供體內相關性。

近年來已有研究表明，NLRP3炎癥小體激活與肝臟纖維化進程關系密切[47, 66-67]。Auvro R等[47]在MCD喂養的小鼠中的結果證明，應用NLRP3炎癥小體小分子抑制劑MCC950，可以有效抵抗肝纖維化發展以及膠原沉積的減少。在更長期的肥胖/糖尿病模型中，16周至24周的數據進一步證明了這一發現，并表明一旦NASH發生，NLRP3抑制劑治療可能阻止或消除肝纖維化，但是MCC950阻斷NLRP3逆轉NASH中晚期肝纖維化的程度，需要在進一步的研究中證實。Maria等[67]的結果表明，HSC中NLRP3的持續激活導致肝臟中α-SMA和結蛋白陽性細胞的比率顯著上調，促進膠原分泌的自發增加和肝纖維化的發展。而這些纖維化變化發生在沒有炎性浸潤的情況下，突顯了NLRP3炎性小體在HSC活化和肝纖維化反應中的直接作用。Wree A等[66]研究結果表明，NLRP3持續激活4周后，將會導致趨化因子(如ICAM1和CXCL2)顯著上調，肝臟炎癥表現為炎癥分級增加，浸潤性骨髓細胞數量以及pro-caspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平升高。在飲食誘導的小鼠肝臟中，NLRP3炎癥小體的激活進一步增加HSC活化，具有顯著的促纖維化反應。這些結果表明，持續的NLRP3激活作為一種重要的“打擊”，有助于脂肪變性在NAFLD發展過程中作為“第一次打擊”，導致更嚴重的肝臟損傷展。

4 小 結

近年來，炎癥在NAFLD疾病進展中的作用越來越受到重視，對其機制的研究也越來越多。依賴于NLRPs炎癥小體激活的細胞焦亡也是這些年的研究熱點，其引起的炎癥應答也被認為是疾病進展的推動者。各類NLRPs影響NAFLD疾病進展的不同的分子機制還需我們進一步的探究。