絲素纖維人工韌帶材料表面改性及其體外礦化性能

程志，吳佳蔚，王一婷，王璐，關國平

東華大學紡織學院，紡織面料技術教育部重點實驗室(上海，201620)

【關健詞】 人工韌帶； 絲素纖維； 多巴胺； 表面改性； 礦化

0 引言

在劇烈運動及意外情況下，人體韌帶常由于過度受力而發生挫傷、斷裂或缺損[1-2]。對于輕度的挫傷或撕裂，通常采用物理康復或藥物治療。而對于韌帶斷裂及缺損的病例，人工韌帶移植則是主要治療方法[3]。據調查，美國每年約有10萬～15萬例病患需接受前交叉韌帶重建手術，以恢復膝關節的正常結構和功能[4]。目前臨床可使用的人工韌帶是以LARS為代表的人工合成材料人工韌帶， 多屬于生物“惰性”材料，不能為種子細胞提供良好的生物界面。因此，人工韌帶在骨髓道中愈合效果不理想，移植物與骨界面之間易分離或形成疤痕組織[5-6]。因此，為了提高愈合效果，人工韌帶表面涂層、接枝等改性研究日益增加，期望提高材料表面礦化效果[7]。

絲素蛋白纖維具有良好的力學性能、生物相容性和可降解性能，用作外科縫合線已有上百年歷史，是生物材料領域最有發展前景的材料之一[8]。開發絲素蛋白纖維人工韌帶，有望同時滿足對新型人工韌帶材料力學性能、生物相容性及生物降解性等方面的要求。為了提高絲素蛋白纖維材料表面的生物礦化及骨愈合能力，可采用貽貝仿生材料多巴胺對其表面進行改性[9-10]。在弱堿性條件下，多巴胺可以在濕態下發生氧化自聚反應，其自聚產物聚多巴胺(pDA)能夠牢固附著在固體基質表面，且具有優良的生物相容性[11-12]。此外，pDA結構中含有大量的酚羥基和氨基，能與有機分子或聚合物發生邁克爾加成反應和席夫堿反應[15-16]，并將生物活性分子引入到材料表面以促進有機基質礦化[13-14]。因此，本研究擬采用編織方法成型絲素纖維人工韌帶，采用多巴胺溶液進行改性而獲得具有體外礦化性能的人工韌帶材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑蠶絲(線密度為80支，天津彩虹線業)； 鹽酸多巴胺(分析純，美國Sigma)； 氯化鈣(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)； 無水碳酸鈉、磷酸氫二鈉和三(羥甲基)氨基甲烷(均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司)； L929成纖維細胞(中國科學院細胞所)。TP-114精密電子天平(丹佛儀器有限公司)； HYG-B全溫搖瓶柜； Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀(美國Thermo Fisher)； HD-300低溫等離子處理儀(常州中科常泰等離子體科技有限公司)； JSM-5600LV掃描電子顯微鏡(JEOL日本電子株式會社)； DL-2003(16)常溫震蕩染色試驗機(蘇州絲達樂印染機械有限公司)； Quanta250環境掃描電子顯微鏡； C12錠編織機(上海哈考線帶設備有限公司)；DHG-9055A電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)； S-4800 場發射掃描電子顯微鏡； Escalab 250Xi X射線光電子能譜儀； MULTISKAN MK3酶標儀(美國Thermo)； D/max-2550VB+/PC 18 kW轉靶X射線衍射儀(日本)。

1.2 人工韌帶的設計與成型

參考人工韌帶臨床移植術式及LARS?人工韌帶結構，將人工韌帶設計為兩端緊密中間疏松的結構，以保證人工韌帶具有足夠的力學性能和關節腔內的靈活性。將兩端長度定為50～70 mm，中間長度定為20～30 mm。采用絲素纖維股線為原材料，在C12錠編織機上編織成型絲素纖維人工韌帶材料(SF)。制備絲素纖維的方法為，利用震蕩染色機進行桑蠶絲纖維的脫膠，采用濃度為0.5%的碳酸鈉水溶液，在溫度為98 ℃條件下，對桑蠶絲脫膠30 min。脫膠后進行快速清洗。重復3次后低溫干燥[15]。

1.3 多巴胺涂層[11]

在真空度為10 Pa，放電功率為100 W，放電時間為120 s的參數下，用氧氣等離子體對SF表面進行處理[16]。隨后立刻浸入濃度為2.5 mg/mL的多巴胺溶液中20 h，溫度26 ℃，pH 8.5。取出后去離子水清洗，室溫下真空干燥24 h，得到聚多巴胺涂層的絲素纖維人工韌帶材料(SF-pDA)。

1.4 體外礦化[17]

將SF組和SF-pDA組樣品分別浸入裝有200 mM/L CaCl2溶液的燒杯中，燒杯置于37 ℃，轉速為120 r/min的恒溫搖床上振蕩1 h。再將樣品轉移到濾紙上除去多余的水分，隨后浸入120 mM/L的Na2HPO4溶液中，同上振蕩1 h。交替浸泡4個周期后，去離子水洗凈，室溫下真空干燥24 h，得到礦化的絲素纖維人工韌帶材料(SF-ACP)和礦化的聚多巴胺涂層絲素纖維人工韌帶材料(SF-pDA-ACP)。

1.5 掃描電子顯微鏡觀察

采用S-4800場發射掃描電子顯微鏡對SF、SF-pDA、SF-ACP和SF-pDA-ACP四組材料進行表面形貌觀察，加速電壓為5 kV。

1.6 傅里葉紅外光譜測試

采用Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀，通過ATR衰減全反射法，對SF、SF-ACP、SF-pDA和SF-pDA-ACP四組樣品進行測試，掃描范圍500～4 000 cm-1。

1.7 X射線光電子能譜測試

采用Escalab 250Xi 型X射線光電子能譜儀，對SF和SF-pDA的C、N、O元素進行定量測試。測試條件為：ALKa(hv=1 486.6 eV)，全譜掃描時通能為187.85 eV、窄譜掃描時通能為29.35 eV，Cls電子結合能284.6 eV校準荷電效應。

1.8 X射線能譜測試

采用Quanta250環境掃描電子顯微鏡對SF-ACP和SF-pDA-ACP的Ca、P元素進行能譜定量分析(EDS)，加速電壓為10 kV。

1.9 X射線衍射測試

采用D/max-2550VB+/PC*18KW轉靶X射線衍射儀，對材料表面礦化的磷酸鹽晶型進行測試。測試條件為，Cu陽極靶射線，電壓為40 kV，電流為200 mA，起始角為2°，終止角為50°，掃描速度為12°/min。

1.10 細胞活性

將SF、SF-pDA兩種人工韌帶材料滅菌后放入24孔板中(n=3)，種植L929成纖維細胞后放入37 ℃、5% CO2培養箱中培養。分別在培養1、4和7 d后取出24孔板，每孔加入100 μL CCK-8試劑，繼續培養4 h后，將每孔中的溶液轉移到96孔酶標板中，每孔加入100 μL，使用酶標儀于波長450 nm處測定吸光度值。

1.11 數據統計分析

每組樣品的最終實驗數據以 SD表示，應用SPSS 11.0軟件進行統計學分析，組間均數的差異比較采用方差分析法，P<0.05為顯著差異(*)，P<0.01為極顯著差異(**)。

2 結果與討論

2.1 人工韌帶形態結構

本研究編織成型的絲素纖維人工韌帶材料如圖1所示，該人工韌帶共分為三段，具有緊密結構的兩端和疏松結構的中間部分。兩端長度為(50±7) mm，中間長度為(28±3) mm。由于編織角越小編織結構就越疏松，因此可通過調節編織角來控制人工韌帶不同部位的結構。如圖1B所示，將人工韌帶兩端的編織角設置為(45±2)°時，結構緊密。由于兩端需要植入骨道內用擠壓螺釘固定，故這種緊密結構可以增加纖維與螺釘間的摩擦力，提高固定牢度。如圖1C所示，當改變編織角為(30±2)°時，獲得的中間部分結構較為疏松。由于中間部分將位于關節腔，故疏松結構有利于保持關節活動的靈活性。

圖1 絲素纖維人工韌帶照片(A：正體，B：兩端，C：中間)

2.2 掃描電鏡形貌分析

SF、SF-pDA、SF-ACP和SF-pDA-ACP的SEM結果如圖2所示。SF的纖維表面光滑(圖2A)，而SF-pDA纖維表面變得粗糙，纖維之間有黏連并且有小顆粒沉積在纖維表面(圖2B)，說明pDA已經涂層在纖維表面。經礦化后，SF-ACP組纖維表面可見明顯的ACP顆粒沉積，但沉積顆粒尺寸及分布不均勻(圖2C)。而經pDA涂層后的SF-pDA-ACP組，礦化后纖維表面可見大量ACP沉積，且包覆整個纖維表面(圖2D)。這是由于pDA形成的均勻薄膜使得Ca元素可以通過與pDA薄膜結合的方式，均勻地覆蓋在SF-pDA-ACP表面，從而促進有機基質礦化[18]，提高了ACP生成的量?？梢姡琾DA涂層可使得SF-pDA-ACP表面的礦化層更加均勻，礦化效果得到提高。

圖2 SF(A)、SF-pDA(B)、SF-ACP(C)和SF-pDA-ACP(D)SEM結果Fig.2 SEM images of SF(A)，SF-pDA(B)，SF-ACP(C)and SF-pDA-ACP(D)

2.3 紅外光譜分析

采用傅里葉紅外光譜儀分別對四組人工韌帶材料進行結構分析，結果如圖3所示。SF組在1 623 cm-1和1 510 cm-1出現β-sheet結構中的酰胺Ⅰ與酰胺Ⅱ的特征峰，1 228 cm-1出現silk-Ⅰ型結構中酰胺Ⅲ吸收峰[19-20]。而SF-pDA組在1 514 cm-1和1 619 cm-1處出現兩個新峰，前者對應于pDA吲哚結構中N-H的彎曲振動，后者來源于pDA的苯環骨架振動。但由于pDA的涂層量較少，且pDA的兩個特征峰與SF的特征峰位置接近，導致SF和SF-pDA的紅外圖相似，但可以看出，在1 619 cm-1處SF與pDA的峰疊加，使得該處峰強度加深。而且，SF-ACP和SF-pDA-ACP均在602 cm-1和691 cm-1處出現兩個吸收峰，為PO43-基團的彎曲振動峰[21]，SF-ACP在1 027 cm-1處出現P-O基團的特征吸收峰[18]，1 513 cm-1處出現CO3-2基團的特征吸收峰。SF-pDA-ACP組在1 044 cm-1處出現P-O基團的特征吸收峰，1 520 cm-1處出現CO3-2基團的特征吸收峰。這些結果表明，磷酸鈣化合物沉積在SF和SF-pDA表面。

圖3 SF、SF-ACP、SF-pDA和SF-pDA-ACP的FTIR結果Fig.3 FTIR spectra of SF，SF-ACP，SF-pDA and SF-pDA-ACP

2.4 X射線光電子能譜分析

在FTIR圖譜中，由于SF與SF-pDA的差異不明顯，為了進一步確認pDA在SF表面的存在，對SF和SF-pDA進行XPS測試，結果如表1所示。從表1可以看出，與SF相比，經過pDA涂層后，SF-pDA的C、N、O元素百分比、N/C比及O/C比均介于DA值與SF值之間，說明pDA涂層已經存在于SF表面。

表1 XPS分析絲素纖維與聚多巴胺涂層絲素纖維表面的化學組成

2.5 X射線能譜分析

采用環境掃描電子顯微鏡對SF-ACP和SF-pDA-ACP的Ca、P元素進行能譜定量分析，測得Ca:P摩爾比均為1.57，接近人體天然骨的Ca:P摩爾比[22]。有研究表明[23]，Ca2+是磷酸鈣表面吸附成骨細胞配體蛋白的活性位，因此礦化層Ca元素含量越高，越有利于成骨細胞的粘附增殖，促進新生骨生成，縮短移植物與骨的愈合過程。圖4為SF-ACP和SF-pDA-ACP的Ca元素分析結果?？梢钥闯鯯F-pDA-ACP與SF-pDA表面礦化層的Ca元素含量具有顯著性差異(P<0.01)，SF-pDA-ACP的Ca元素占比要明顯高于SF-ACP。這是由于pDA本身帶有的酚羥基可以與Ca2+共價結合[23]，為Ca2+在SF-pDA表面上生長提供了大量的結合位點。結果表明，pDA涂層提高了SF的礦化效果。

圖4 SF-ACP和SF-pDA-ACP的Ca元素含量Fig.4 Ca content on SF-ACP and SF-pDA-ACP

2.6 X射線衍射分析

采用轉靶X射線衍射儀對礦化后的磷酸鈣晶型進行分析，結果如圖5所示。可以看出，在30°附近有個饅頭峰，說明得到的產物為無定型磷酸鈣(ACP)，而在XRD圖譜中沒有發現其他物質的衍射峰，說明得到的ACP為純相，而且，有研究發現ACP的骨傳導性以及成骨細胞粘附性能比羥基磷灰石更佳。因此，本研究采用交替沉積方法礦化生成的ACP可能具有更好的骨愈合效果。

2.7 細胞活性

通過在SF和SF-pDA人工韌帶材料上種植L929成纖維細胞，來評價材料上的細胞活性，結果如圖6所示。在培養1 d后，SF，SF-pDA與空白對照組的細胞活性無顯著性差異。在培養4 d后，空白對照組的細胞生長明顯優于SF，而SF-pDA與空白對照無顯著性差異。在培養7 d后，空白對照的吸光度與SF接近，而SF-pDA要明顯高于空白對照組(P<0.05)。這就說明，SF與SF-pDA均具有良好的細胞相容性，經pDA涂層后材料的細胞相容性提高。

圖5 礦化生成磷酸鈣的XRD圖

圖6 細胞活性實驗結果Fig.6 Results of cell viability

3 結論

本研究根據人工韌帶臨床移植術式需要，設計并編織成型了一種三段式雙結構絲素纖維人工韌帶原型。通過調節編織角可對人工韌帶不同部分的結構和性能進行調控。多巴胺涂層可明顯促進絲素纖維人工韌帶材料的體外礦化效果，形成無定形結構的鈣磷鹽。涂層人工韌帶材料具有良好的細胞相容性。