25-羥維生素D檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

饒華春 粘少碩 莊躍玲

（泉州市正骨醫(yī)院，福建 泉州 362000）

維生素D是一固醇類衍生物，由不同的維生素D原經(jīng)過(guò)紫外線照射后形成。研究發(fā)現(xiàn)維生素D與人體健康關(guān)系密切，主要參與骨骼效應(yīng)中的鈣磷代謝，具有抗佝僂病的作用[1]；同時(shí)還與腫瘤、高血壓、心血管疾病、免疫性疾病、糖尿病、哮喘及感染等疾病相關(guān)[2]。所以了解體內(nèi)維生素D的含量對(duì)相關(guān)疾病的診斷非常重要。25-羥基維生素D（25（OH）D）由維生素D通過(guò)在肝臟的羥基化作用轉(zhuǎn)化而來(lái)，是維生素D在體內(nèi)的主要存在形式。血清內(nèi)25（OH）D的含量高低與體內(nèi)維生素D的儲(chǔ)存水平是相關(guān)的，并可同時(shí)反應(yīng)維生素D缺乏的癥狀。因此，現(xiàn)階段臨床上將25（OH）D作為體內(nèi)維生素D含量水平的最佳指標(biāo)。

1 25-羥基維生素D生物學(xué)特征

食物攝取和陽(yáng)光紫外線照射皮膚是人體補(bǔ)充維生素D的主要方式，該方式和自身合成的維生素D經(jīng)過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入肝臟，在肝臟羥化酶的羥化作用下形成25（OH）D，隨后25（OH）D與α球蛋白結(jié)合經(jīng)過(guò)循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)腎臟并在羧化酶的作用下形成具有活性的1，25-二羥基維生素D。近些年，維生素D的生理意義越來(lái)越廣，不僅參與調(diào)節(jié)鈣磷代謝維持鈣、磷的濃度穩(wěn)定，同時(shí)還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞分化等，在諸如心血管疾病、感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、慢性腎病及代謝綜合征等各種疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程起著重要的作用。因此體內(nèi)維持維生素D含量的穩(wěn)定非常重要，其含量水平過(guò)低或者過(guò)高都會(huì)引發(fā)不同程度的疾病及相關(guān)癥狀。2010年美國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院給出指導(dǎo)性意見(jiàn)，推薦血清25（OH）D濃度大于20 ng/mL有利于骨骼健康，大于150 ng/mL可能會(huì)引起中毒，不過(guò)這種現(xiàn)象較為罕見(jiàn)。據(jù)報(bào)道，目前全球缺乏維生素人口超過(guò)10億人。

2 25-羥基維生素D檢測(cè)方法

現(xiàn)階段血清中25（OH）D的檢測(cè)方法眾多，由于25（OH）D的脂溶性以及其他代謝產(chǎn)物的存在使得25（OH）D的準(zhǔn)確檢測(cè)較難還沒(méi)有形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，按照檢測(cè)原理主要有免疫法和色譜法。其中免疫法根據(jù)標(biāo)記技術(shù)的不同又可以分為酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、化學(xué)發(fā)光法等；色譜法主要包括高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，大量文獻(xiàn)表明不同的技術(shù)和不同標(biāo)準(zhǔn)操作程序之間存在一定的差異。

2.1 免疫法：免疫法是目前臨床檢測(cè)25（OH）D的核心方法，是一種基于抗原抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)技術(shù)。1971年第一種被利用于臨床檢測(cè)的免疫法是競(jìng)爭(zhēng)性蛋白結(jié)合法（CPAB），是用人工合成的維生素D與樣本中的維生素D結(jié)合蛋白特異性結(jié)合，進(jìn)而反推出血清中25（OH）D的含量，該方法步驟繁雜、耗費(fèi)時(shí)間，無(wú)法滿足臨床高通量、簡(jiǎn)便的要求因而逐漸被淘汰。上世紀(jì)八十年代，放射免疫法（RIA）被研究人員關(guān)注，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)及簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)一度成為國(guó)內(nèi)外檢測(cè)25（OH）D的主要方法，90年代進(jìn)一步優(yōu)化，然而RIA由于失蹤同位素的存在對(duì)操作人員有一定的放射性使得它不能廣泛的應(yīng)用。隨著技術(shù)的發(fā)展，新的標(biāo)志物和標(biāo)記方法不斷的被發(fā)現(xiàn)利用于臨床診斷，目前國(guó)內(nèi)使用較多的免疫法有酶聯(lián)免疫法（ELISA）、化學(xué)發(fā)光免疫法（CLIA）和電化學(xué)發(fā)光免疫法（ECLIA）。ELISA是相對(duì)最早利用于臨床的免疫技術(shù)，其采用酶催化反應(yīng)生成有色可溶性物質(zhì)對(duì)樣本中成分進(jìn)行標(biāo)記并定量，而CLIA和ECLIA都采用發(fā)光示蹤技術(shù)對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，光電倍增管檢測(cè)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度回算樣品中25（OH）D的濃度，三種檢測(cè)方法各有優(yōu)劣。李光[3]在研究25（OH）D在骨質(zhì)疏松診斷中的應(yīng)用時(shí)采用ELISA和CLIA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種檢測(cè)方法相關(guān)性較好（r=0.86，P＜0.05），但ELISA結(jié)果離散程度大且都高于CLIA的結(jié)果，同時(shí)ROC曲線分析顯示CLIA法要優(yōu)于ELISA法。武姍姍[4]收集40例臨床血清標(biāo)本檢測(cè)25羥基維生素D，用于評(píng)價(jià)ELISA法和ECLIA法的一致性。兩種方法所得的結(jié)果重復(fù)性及相關(guān)性良好（r=0.994），但兩組結(jié)果的預(yù)期偏差大于預(yù)設(shè)的允許誤差，檢測(cè)結(jié)果不一致需按照回歸方程對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整后才具有可比性。云春風(fēng)等[5]在參考了NCCLS-EP9-A2文件后對(duì)ELISA和CLIA兩種方法用于檢測(cè)血清25（OH）D進(jìn)行了相關(guān)性和一致性研究，結(jié)果兩種方法的相關(guān)系數(shù)達(dá)到r=0.981，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)隨著樣品濃度的升高，兩種檢測(cè)方法結(jié)果之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差逐漸減小，該研究說(shuō)明ELISA和CLIA在檢測(cè)血清中25（OH）D濃度時(shí)相關(guān)性和重復(fù)性都較好。

2.2 色譜法：色譜法基本原理是利用樣品混合物中各組分理化性質(zhì)不同，各組分不同程度的分配到互不相溶的兩相中，當(dāng)兩相進(jìn)行相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)各組分在兩相中反復(fù)多次重新分配最終達(dá)到分離的效果。用于血清中25（OH）D檢測(cè)的主要是高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）。HPLC是較早應(yīng)用的色譜法，與免疫法相比色譜法在特異性、靈敏度和準(zhǔn)確性方面優(yōu)勢(shì)明顯并可以同時(shí)檢測(cè)25-（OH）D3和25-（OH）D2，具有分析速度快、分離效能高、重復(fù)性好、精確度高、節(jié)約成本、可自動(dòng)化等特點(diǎn)。HPLC的不足之處是檢測(cè)設(shè)備非常昂貴，所需樣本量大，樣品的前處理較為復(fù)雜，檢測(cè)通量較小，這些因素使該方法只能在一些大型醫(yī)院或高級(jí)科研院校才能使用。隨著技術(shù)的發(fā)展HPLC被更加先進(jìn)的LC-MS/MS逐漸代替，目前LC-MS/MS已經(jīng)是檢測(cè)25（OH）D最常用的色譜法技術(shù)。LC-MS/MS的檢測(cè)器是串聯(lián)質(zhì)譜儀，可以實(shí)現(xiàn)分子、離子等2次質(zhì)量的選擇分離，是國(guó)際公認(rèn)的檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。同樣LC-MS/MS具有HPLC相同的缺點(diǎn)限制了它的臨床推廣應(yīng)用。

宋斌斌等[6]建立了LC-MS/MS定量檢測(cè)血清25（OH）D的方法，利用Waters的液質(zhì)聯(lián)用儀參照美國(guó)食品藥品管理局（FDA）的生物分析方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果該方法檢測(cè)線性范圍為6.25～500 nmol/L，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)（CV）分別＜4%和＜6%，完全符合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。韓吉春等[7]以干血點(diǎn)為樣本建立了LC-MS/MS高通量25（OH）D檢測(cè)體系，該體系所需樣本量?jī)H約6 μL，整個(gè)樣本前處理采用全自動(dòng)化平臺(tái)最終實(shí)現(xiàn)高通量。張旋等[8]采用化學(xué)發(fā)光法和LC-MS/MS進(jìn)行性能驗(yàn)證和評(píng)估，兩種方法在靈敏度、精密度和線性范圍等方面符合性均較好。張?zhí)煊潞椭苎┥廩9]對(duì)HPLC和ELISA檢測(cè)血清25（OH）D3進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果兩種檢測(cè)方法相關(guān)性良好但不一致，ELISA的檢測(cè)結(jié)果需要按照回歸方程調(diào)整后才具有可比性，存在偏差。

3 結(jié) 論

維生素D作為人類重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與眾多疾病相關(guān)，因此保證其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性對(duì)相關(guān)疾病的診療非常重要，LC-MS/MS具有靈敏度和準(zhǔn)確性都較高的特點(diǎn)，是檢測(cè)25（OH）D的金標(biāo)準(zhǔn)，但是礙于前期設(shè)備投入大、專業(yè)技術(shù)要求高等原因使得該技術(shù)無(wú)法大面積的推廣應(yīng)用，而目前化學(xué)發(fā)光技術(shù)因其自動(dòng)化及高通量等特點(diǎn)，深受醫(yī)院檢驗(yàn)人員歡迎。隨著研究的不斷深入及相關(guān)技術(shù)的推廣，未來(lái)25（OH）D的檢測(cè)方法和儀器主要往用血量少、自動(dòng)化程度及高通量等方面發(fā)展。