食品中黃曲霉毒素檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

史春悅

（天津市南開(kāi)區(qū)教育后勤服務(wù)中心，天津 300190）

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFs） 主要是由黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉 （Aspergillus paraciticus）產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]。這類真菌在自然界中，尤其是在高溫高濕的熱帶和亞熱帶地區(qū)分布廣泛、污染范圍廣，谷物、豆類、堅(jiān)果、油脂、調(diào)味品、乳制品等易受其污染[2]。

已知的黃曲霉毒素有20多種，在自然條件下產(chǎn)生的黃曲霉毒素主要包括AFB1，AFB2，AFG1和AFG2[3]。根據(jù)其在紫外照射下產(chǎn)生的熒光顏色不同，主要分為黃曲霉毒素B（Blue） 與黃曲霉毒素G（Green）。B族黃曲霉毒素包括黃曲霉毒素B1（AFB1）和黃曲霉毒素B2（AFB2），在紫外照射下呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，主要由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生；G族黃曲霉毒素包括黃曲霉毒素G1（AFG1）和黃曲霉毒素G2（AFG2），在紫外照射下呈現(xiàn)綠色熒光，主要由黃曲霉菌產(chǎn)生[4-5]。AFM1由AFB1通過(guò)體內(nèi)代謝產(chǎn)生，泌乳動(dòng)物食用受AFB1污染的食物或飼料后由乳汁或尿液進(jìn)行分泌[6]。

黃曲霉毒素具有強(qiáng)致癌性和毒性，世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)已將其列為I類致癌物。黃曲霉毒素結(jié)構(gòu)類似物的基本結(jié)構(gòu)均有1個(gè)氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀┖?個(gè)雙呋喃環(huán)，致癌性主要與香豆素結(jié)構(gòu)有關(guān)，毒性主要與二呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)有關(guān)，其中以AFB1最為常見(jiàn)且毒性最強(qiáng)。我國(guó)GB/T 2761—2017國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中真菌毒素的限量，分別規(guī)定了谷物、豆類、堅(jiān)果及其制品等產(chǎn)品中AFB1的限量，限量為0.5～20.0 μg/kg，規(guī)定乳及乳制品中 AFM1的限量為0.5 μg/kg。我國(guó) GB/T 5009.22—2016國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定方法，主要包括同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜-柱前衍生法、高效液相色譜-柱后衍生法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法、薄層色譜法。目前，用于檢測(cè)黃曲霉毒素含量的技術(shù)基于原理不同，大體上可以分為基于色譜分離、熒光檢測(cè)或質(zhì)譜檢測(cè)原理的大型儀器檢測(cè)技術(shù)和基于免疫學(xué)原理的快速檢測(cè)技術(shù)[7]。

1 儀器分析法

用于黃曲霉毒素檢測(cè)的儀器法分析法主要包括高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、超高效液相色譜法（Ultra HP-LC，UHPLC）、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS） 等。

通常使用紫外或熒光檢測(cè)器配合HPLC進(jìn)行檢測(cè)。Campos W E O 等人[8]對(duì)堅(jiān)果中 AFB1，AFB2，AFG1和AFG2進(jìn)行檢測(cè)，樣品經(jīng)甲醇提取、免疫親和柱凈化、高效液相色譜熒光檢測(cè)及柱后衍生化進(jìn)行定量檢測(cè)。Fu Z等人[9]利用UHPLC-UV法對(duì)玉米和花生中的黃曲霉毒素，對(duì)AFB1，AFB2，AFG1，AFG2的最低檢出限分別為0.32，0.19，0.32，0.19 μg/kg。

液相或氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用適用于對(duì)同一樣本中多種待測(cè)物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行定量檢測(cè)，具有較高的靈敏度。Lattanzio V M T等人[10]利用HPLC-MS/MS對(duì)谷物中包括AFB1，AFB2，AFG1和AFG2在內(nèi)的多種真菌毒素同時(shí)進(jìn)行定量檢測(cè)。Vaclavik L等人[11]利用UHPLC-MS/MS對(duì)咖啡豆中34種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)。

儀器分析法靈敏度高，能夠進(jìn)行精確的定量檢測(cè)，可進(jìn)行自動(dòng)進(jìn)樣，從而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)，但由于存在樣本前處理復(fù)雜、試驗(yàn)儀器昂貴等問(wèn)題，難以對(duì)大量樣本進(jìn)行快速檢測(cè)。

2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

免疫學(xué)檢測(cè)方法基于抗原抗體的特異性反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果可以通過(guò)視覺(jué)判斷或者酶標(biāo)儀讀數(shù)，能夠?qū)φ婢舅剡M(jìn)行定性或定量檢測(cè)。該方法具有高特異性、高靈敏性、便于攜帶、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，可以用于真菌毒素的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

2.1 酶聯(lián)免疫分析方法

酶聯(lián)免疫分析方法（ELISA）的原理基于抗體、抗原之間的特異性反應(yīng)及酶的高效催化作用。由于真菌毒素屬于小分子半抗原，通常采用競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)模式。用于標(biāo)記的酶通常是辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶[12]。競(jìng)爭(zhēng)法分為直接競(jìng)爭(zhēng)法和間接競(jìng)爭(zhēng)法。Lawellin D W等人[13]通過(guò)采用辣根過(guò)氧化物酶來(lái)標(biāo)記AFB1半抗原，利用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)玉米中AFB1進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為10 pg/mL。Zhang Q[14]利用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，對(duì)檢測(cè)乳制品中AFM1進(jìn)行檢測(cè)，檢出限達(dá)3 ng/L，回收率為91%～110%。Li P等人[15]利用單克隆抗體10C9建立的ELISA方法，對(duì)花生中黃曲霉毒素總量進(jìn)行檢測(cè)，回收率為87.5%～102.0%，能夠?qū)崿F(xiàn)花生樣品中黃曲霉總量的快速檢測(cè)。

ELISA檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易操作，具有高特異、高靈敏等特性，可對(duì)批量樣本中的黃曲霉毒素進(jìn)行快速檢測(cè)，在農(nóng)產(chǎn)品食品安全檢測(cè)領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用。但在實(shí)際檢測(cè)中可能會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性差、假陽(yáng)性率高等情況，樣品中的氧化酶、蛋白酶等也可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。

2.2 免疫親和檢測(cè)技術(shù)

免疫親和技術(shù) （Immunoaffinity Column，IAC）的原理基于免疫化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行凈化和濃縮，去除樣品基質(zhì)干擾，采用高效液相色譜儀、熒光分光光度儀或ELISA進(jìn)行檢測(cè)，可以提高檢 測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度。免疫親和柱聯(lián)合色譜分析法（IAC-HPLC）將免疫分析方法的快捷、特異性與儀器分析方法的精確性等優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，比傳統(tǒng)的HPLC更穩(wěn)定、可靠，目前已成為黃曲霉毒素定量檢測(cè)的重要方法。Fei Ma等人[16]利用單克隆抗體1C11制備出免疫親和柱，利用IAC-HPLC法檢測(cè)花生、植物油和茶葉中的黃曲霉毒素含量，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2的檢出限分別為 0.25，0.30，0.10，0.18 μg/kg。

2.3 免疫層析法

免疫層析法的原理是將抗原或抗體包被于固相載體硝酸纖維膜上，檢測(cè)時(shí)將樣品加到試紙上的樣品墊，樣品在毛細(xì)管作用下前移與標(biāo)記探針相互作用形成復(fù)合物，可通過(guò)肉眼或?qū)柚盘?hào)采集儀器對(duì)顯色結(jié)果進(jìn)行定性或定量分析。免疫層析試紙條的組分包括樣品墊、標(biāo)記探針固定墊、硝酸纖維膜（NC膜）、吸水墊和底板。

基于膠體金標(biāo)記的免疫層析技術(shù)（GNP-ICA）將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫分析技術(shù)和層析技術(shù)聯(lián)系起來(lái)。宋青龍等人[17]利用該方法研制出一種膠體金快速定量檢測(cè)試劑盒，用于谷物和飼料中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與HPLC檢測(cè)結(jié)果相符。

免疫層析法具有快捷、靈敏、特異的特點(diǎn)，結(jié)果判斷直觀可靠、成本低廉、操作簡(jiǎn)單、不依靠大型儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大規(guī)模樣品檢測(cè)中取得了廣泛應(yīng)用。

2.4 熒光免疫法

熒光免疫法采用熒光標(biāo)記取代酶聯(lián)免疫檢測(cè)法中的酶標(biāo)記，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)對(duì)結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，具有較高的靈敏度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)微量或超微量樣品的檢測(cè)。常用的熒光免疫分析法主要包括熒光免疫分析（Immuno-fluoremetrie Assays，IFMA）、熒光偏振免疫分析 （Fluorescence Polarization Immunoassay，F(xiàn)PIA）、熒光激發(fā)共振能量轉(zhuǎn)移免疫分析（Fluorescence Resonance Energy Transfer Immunoassay，F(xiàn)RETIA）、時(shí)間分辨熒光免疫分析（Time Resolved Fluorescence Immunoassay，TRFIA） 和多組分免疫分析（Multianalyte Immunoassay，MAIA）。

IFMA的原理類似于ELISA，檢測(cè)時(shí)根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度對(duì)待檢物質(zhì)的含量進(jìn)行定性或定量分析。常用的熒光標(biāo)記物為異硫氰酸熒光素。Zhang Z等人[18]利用基于量子熒光的IFMA法對(duì)花生中的AFB1進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為0.016 ng/mL。

FPIA的原理基于抗原抗體結(jié)合物熒光偏振程度的差異，偏振熒光強(qiáng)度與檢測(cè)物質(zhì)的量呈反比。Beloglazova N V等人[19]利用FPIA法對(duì)啤酒中AFB1進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為1 ng/mL。

FRETIA的原理基于2個(gè)不同熒光基團(tuán)之間能量的相互轉(zhuǎn)移。其中，轉(zhuǎn)移能量的熒光基團(tuán)為供體，當(dāng) 2個(gè)熒光基團(tuán)足夠靠近時(shí)，通過(guò)電偶極作用供體分子和受體分子之間發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移。Hui L等人[20]利用基于熒光激發(fā)共振能量轉(zhuǎn)移原理的裝置，實(shí)現(xiàn)了牛奶中AFM1的檢測(cè)。

TRFIA通常以鑭系稀有金屬離子及其螯合劑作為熒光標(biāo)記物。利用時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度確定待檢物質(zhì)的含量。Tang X等人[21]利用TRFIA對(duì)牛奶中AFM1進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為0.03 ng/mL，檢測(cè)時(shí)間只需6 min，與用同樣抗體制作的膠體金試紙條相比靈敏度提高了10倍，與HPLC相比結(jié)果一致。

MAIA通常采用光譜不重疊的多標(biāo)記物，實(shí)現(xiàn)樣本中多指標(biāo)或不同成分的同時(shí)檢測(cè)。Kanungo L等人[22]利用該方法對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 化學(xué)發(fā)光免疫法

化學(xué)發(fā)光免疫法（Chemiluminescent Immunoassay，CLIA），以化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體，利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)的信號(hào)強(qiáng)度，根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)度確定待檢物質(zhì)的含量。根據(jù)標(biāo)記物的不同，可將其分為化學(xué)發(fā)光免疫分析、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析。

化學(xué)發(fā)光免疫分析法的原理是通過(guò)魯米諾或吖啶酯類等試劑直接標(biāo)記抗體或抗原，與待測(cè)物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)。裘雪梅等人[23]采用吖啶酯標(biāo)記AFB1，利用競(jìng)爭(zhēng)性化學(xué)發(fā)光免疫分析法對(duì)黍米樣品中AFB1進(jìn)行檢測(cè)。化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法的原理是基于酶聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)加入化學(xué)發(fā)光底物實(shí)現(xiàn)信號(hào)的檢測(cè)。王巖等人[24]利用于化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法檢測(cè)乳制品中AFM1的含量。電化學(xué)發(fā)光免疫分析法的原理是以電化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體，標(biāo)記后的抗原或抗體與待測(cè)物質(zhì)中的抗體或抗原結(jié)合，形成的復(fù)合物在電場(chǎng)作用下發(fā)生電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度確定待檢物質(zhì)的含量。汪玉等人[25]利用該原理研制了一種基于磁性納米纖維/碳納米角修飾的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于黃曲霉毒素的檢測(cè)。

CLIA與ELISA法相比，具有更高的靈敏度，可用于痕量樣品的檢測(cè)。此外，該方法具有特異性強(qiáng)、線性范圍寬、儀器操作簡(jiǎn)單、成本低廉等特點(diǎn)，適合大批量樣本的檢測(cè)。

2.6 免疫傳感器法

免疫傳感器法基于免疫學(xué)反應(yīng)與傳感器技術(shù)，通過(guò)抗體的選擇性檢測(cè)待檢物質(zhì)，同時(shí)能夠?qū)z測(cè)的結(jié)果轉(zhuǎn)換成相應(yīng)數(shù)據(jù)形式的轉(zhuǎn)換信號(hào)。根據(jù)傳感技術(shù)原理的不同，可分為電化學(xué)免疫傳感器、質(zhì)量檢測(cè)免疫傳感器、熱量檢測(cè)免疫傳感器和光學(xué)免疫傳感器。運(yùn)用該方法進(jìn)行檢測(cè)只需少量樣品可獲得多種目標(biāo)物的檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)限可達(dá)pg-ng級(jí)水平，并且重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高，適用于黃曲霉毒素和其他真菌毒素的混合污染檢測(cè)。

2.7 免疫芯片檢測(cè)法

免疫芯片又稱抗體芯片，基于抗原抗體間的特異性反應(yīng)，芯片上設(shè)置有探針點(diǎn)陣，通過(guò)特異性反應(yīng)捕獲待測(cè)樣本中的靶向蛋白質(zhì)，然后通過(guò)激光圖譜掃描進(jìn)行圖像成像，然后在計(jì)算機(jī)計(jì)算的同時(shí)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，而且可對(duì)大量樣本中多種物質(zhì)進(jìn)行同時(shí)定性或定量分析，分為固相和液相2種模式。免疫芯片技術(shù)可用于樣本中包括黃曲霉毒素在內(nèi)的多種真菌毒素進(jìn)行同步檢測(cè)，具有操作方便、靈敏度高、分析速度快、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

黃曲霉毒素在一定的濕度和溫度條件下，容易引起食品霉變，對(duì)人體健康造成威脅。因此，從源頭發(fā)現(xiàn)控制黃曲霉毒素的危害，加強(qiáng)對(duì)食品中黃曲霉毒素的檢測(cè)研究十分必要。儀器分析法靈敏度高，能夠進(jìn)行精確的定量檢測(cè)，但存在樣本前處理復(fù)雜、對(duì)儀器和操作人員的要求較高、難以對(duì)大量樣本進(jìn)行快速檢測(cè)等問(wèn)題。免疫學(xué)檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、方便快捷的特點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。今后，為實(shí)現(xiàn)更方便快捷、高通量、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求，還應(yīng)在將免疫原理與現(xiàn)代分析技術(shù)相結(jié)合研究開(kāi)發(fā)新型食品安全快速檢測(cè)技術(shù)方面努力。