奧曲肽對肝纖維化大鼠自噬相關蛋白LC3和Beclin-1表達的影響

張 超，張 沖，劉雪琪，孟曉明，潘發明

(安徽醫科大學1. 第一附屬醫院肝膽胰外科、2. 第一附屬醫院腎內科、3. 藥學院、4. 公共衛生學院流行病與衛生統計學系，安徽 合肥 230022)

肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝臟對慢性肝損傷因素(如酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎等)創傷修復應答的結果，以胞外基質合成與分解平衡紊亂為特征。肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)在HF進展中起到重要作用。當肝臟受到急性或慢性損傷時，靜止的HSC變成活化狀態，轉變為成纖維細胞，活化的HSC是細胞外基質的主要來源[1]。

自噬是在胞內將受損的細胞器降解，為細胞生存提供可重復利用物質和能量的過程，在維持胞內穩態中起到重要作用。有研究報道[2]，在HSC活化過程中，自噬潮增加，通過自噬抑制因子干預自噬可抑制HSC的活化。奧曲肽(octreotide，OCT)是一種生長抑素類似物，前期研究表明，OCT可緩解大鼠HF程度[3]，但OCT是否通過調節自噬發揮抗纖維化作用仍未明了。因此，本研究建立CCl4肝纖維化模型，探討自噬在HF中的作用以及OCT對其的影響。

1 材料

1.1實驗動物清潔級♂SD大鼠30只，體質量200～250 g，購于安徽醫科大學實驗動物中心，常溫下自由飲水，普通飼料喂養。

1.2試劑用橄欖油將CCl4配成40%混合溶液；OCT(0.1 mg·mL-1)購于瑞士諾華公司；ECL發光試劑購于美國Thermo Fisher公司；抗Collagen I和α-SMA單克隆抗體，購于Proteintech公司；抗LC3和Beclin-1單抗購于Abcam公司；抗β-actin單抗、二抗，購于北京中杉金橋生物技術公司。

2 方法

2.1動物分組及造模大鼠隨機分為對照組、模型組和OCT組，每組10只。除對照組外，均采用皮下注射40% CCl4(3 mL·kg-1)，每周2次。OCT組采用皮下注射OCT 10 μg·kg-1，每日2次。同時對照組和OCT組均皮下注射等體積生理鹽水。造模8周后處死大鼠，收集待測標本。

2.2血清學檢測全自動生化分析儀(安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科)檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)和白蛋白(ALB)的含量。

2.3HE和Masson染色觀察肝組織病理學變化取肝組織置于10%甲醛溶液中固定，脫水，包埋后切片，行HE和Masson染色，拍照并分析。

2.4Westernblot法檢測大鼠肝組織CollagenⅠ、α-SMA、LC3和Beclin-1蛋白表達提取蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品經SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉，一抗4 ℃孵育過夜。次日TBST洗膜3次后，置于相應二抗中，常溫孵育1 h。ECL發光試劑盒顯影，并用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

3 結果

3.1大鼠血清學指標變化Tab 1結果顯示，與對照組相比，模型組中大鼠ALT、AST和TBIL水平上升，ALB水平明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，OCT組ALT、AST和TBIL均降低，ALB水平增加，差異有統計學意義(P<0.05)。

3.2大鼠肝組織病理學改變HE染色顯示，對照組肝小葉結構完整，肝細胞大小、形態正常，呈以中央靜脈為中心的輻射狀，肝索排列整齊，無膠原纖維增生；模型組出現大量脂肪變性，肝實質、肝小葉和肝索結構被破壞，匯管區及周邊組織有大量膠原結締組織增生；OCT組肝脂肪變性，結締組織增生程度減輕。Masson染色顯示，對照組僅見匯管區有少量藍色膠原纖維，未見纖維增生；模型組見匯管區及周圍有大量藍色膠原纖維增生，肝小葉結構被破壞形成假小葉；OCT組見增生的膠原纖維明顯減少，假小葉數量減少。

Tab 1 Levels of TBIL, AST, ALT and ALB in serum of

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Tab 2 Effects of OCT on protein expression of Collagen Ⅰ,α-SMA, LC3 and Beclin-1 in

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.3大鼠肝組織CollagenⅠ、α-SMA、LC3和Beclin-1蛋白表達變化Tab 2的Western blot半定量結果顯示，Collagen Ⅰ、α-SMA、LC3和Beclin-1蛋白在模型組中的表達水平較對照組升高(P<0.05)；相比于模型組，OCT組中Collagen Ⅰ、α-SMA、LC3和Beclin-1蛋白表達水平下降(P<0.05)。

4 討論

自噬在HF的發生中起兩面性作用。一方面，自噬具有促肝纖維化作用。當HSC發生自噬時，消化胞內脂滴為HSC活化提供能量，誘導I型膠原合成，加速HF進程[4]。另一方面，自噬又具有抗肝纖維化作用。通過去除過度沉積的脂滴、異常折疊的蛋白和受損的線粒體，減少氧化應激和脂質過氧化的損傷，從而維持受損肝細胞胞內的能量平衡。自噬又可促使單核細胞分化為巨噬細胞，巨噬細胞自噬能夠防止過多的炎癥介質釋放，而抑制巨噬細胞自噬可促使炎癥介質的分泌，炎癥介質又可促進單核細胞和中性粒細胞在肝組織中集聚，誘導肝細胞凋亡，從而通過抗炎作用發揮抗纖維化作用[5]。

有研究表明[6]，OCT可通過抑制自噬減輕腎損傷的發生，為此我們建立CCl4肝纖維化大鼠模型，并用OCT干預。結果表明，模型組大鼠肝功能異常，HE和Masson染色均顯示肝組織有不同程度纖維化，說明HF模型成功建立。模型組中大鼠肝組織LC3和Beclin-1含量高于對照組，表明在CCl4誘導的HF大鼠肝組織中，自噬標志性蛋白LC3和Beclin-1的表達水平上升，證明自噬促進HF的發生。在OCT組中，大鼠HF程度相比于模型組明顯減輕，Collagen Ⅰ、α-SMA、LC3和Beclin-1蛋白含量均下降，表明OCT抑制HF可能與其通過下調自噬標志性蛋白LC3和Beclin-1的表達，進而抑制自噬的發生，減少HSC的活化有關。

綜上，OCT可通過減輕肝臟病理損傷，下調Collagen I和α-SMA的表達而抑制HF，同時下調LC3和Beclin-1的表達而抑制過度自噬，緩解HF。我們將會在體外實驗中進一步探索自噬及其相關蛋白在HF進展中的變化及作用。