丹酚酸B對糖尿病大鼠腎纖維化的改善作用及其機制

張 旭，朱元美，唐保露，任尤楠，陶善珺，楊解人，鄭書國,3,4

(皖南醫學院 1. 藥理學教研室、2. 解剖學教研室、3. 定量藥理研究所、4. 藥物研發中心，安徽 蕪湖 241002)

糖尿病腎病是糖尿病最嚴重和最常見的并發癥之一，也是導致終末期腎病的最重要原因之一，若不及時采取措施，可最終發展成為慢性腎衰竭或尿毒癥，從而危及患者生命[1]。糖尿病腎病的主要病理特征是腎纖維化，表現為成纖維細胞的異常增殖及由此導致的細胞外基質的過度堆積[2]。大量研究表明，氧化應激在糖尿病腎病發生發展過程中起著重要作用[3]，而轉化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)/Smad信號通路的異常激活是糖尿病腎病腎纖維化的主要分子機制[4]。因此，有效改善糖尿病氧化應激狀態和調控TGF-β1/Smad信號通路，成為防治糖尿病腎病腎纖維化、改善糖尿病預后的重要措施之一。

丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)是丹參的主要成分之一，具有較強的抗氧化活性，能明顯抑制間歇性高糖誘導的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)活化和INS-1細胞凋亡[5]。Sal B可有效抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞向間質細胞轉分化，減少膠原蛋白等細胞外基質合成與分泌[6]，但對其能否抑制糖尿病腎臟纖維化目前研究較少。本研究采用高糖高脂飲食，合并腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)的方法建立糖尿病大鼠模型，觀察Sal B對糖尿病大鼠腎纖維化的改善作用，并從TGF-β1/Smad信號通路探討其可能的作用機制。

1 材料

1.1實驗動物Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，SPF級，♂，體質量(220±20)g，購于浙江省實驗動物中心，合格證號：SCXK(浙)2014-0001。

1.2藥物與試劑Sal B(純度80%)，西安文竹生物科技有限公司；STZ，Sigma公司；血糖儀及血糖試紙，三諾生物傳感股份有限公司；尿微量白蛋白(urine micro-albumin，UAlb)檢測試劑盒，上海生物科技有限公司；I型和III型膠原蛋白檢測試劑盒、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、肌酐(serum creatinine, SCr)檢測試劑盒，南京建成生物科技有限公司；β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記抗體、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, TAC)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)測定試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)，碧云天生物技術研究所；TGF-β1抗體、p-Smad2、Smad2抗體，北京博奧森生物技術有限公司；Smad7 抗體，武漢博士德生物工程有限公司。

1.3儀器高速冷凍離心機(Eppendorf公司)；M200 PRO多功能酶標儀(Tecan公司)；電泳、轉印系統(Bio-Rad公司)；FluorChem FC3化學發光成像系統(Proteinsimple公司)；Axio Vert.A1顯微成像系統(Carl Zeiss公司)。

2 方法

2.1糖尿病模型的建立與給藥SD大鼠50只，適應性喂養1周，自由進食和飲水。隨機選取10只作為正常對照組，普通飼料喂養。其余大鼠喂飼高糖高脂飼料(10%豬油、10%蔗糖、5%蛋黃粉、1%膽固醇和 74%普通飼料)4周后，禁食12 h，腹腔注射1% STZ溶液(40 mg·kg-1，0.1 mmol·L-1檸檬酸緩沖液配制，pH 4.4)誘導糖尿病，1周后以隨機血糖≥16.7 mmol·L-1作為糖尿病模型建立成功。將糖尿病大鼠隨機分為模型組、Sal B低劑量組(Sal B 80)、Sal B高劑量組(Sal B 160)，Sal B各組每天灌胃給予Sal B(80、160 mg·kg-1·d-1)，正常對照組和模型組大鼠給予等體積蒸餾水，連續6周。其間每周稱量體質量1次，根據體質量調整給藥劑量。

2.2生化指標檢測實驗結束時，用代謝籠收集大鼠24 h尿液，按試劑盒說明檢測尿微量蛋白含量；大鼠禁食12 h，血糖試紙測定空腹血糖水平；1%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，分離血清，按試劑盒說明測定SCr、BUN、MDA、TAC水平及SOD活力。

2.3腎纖維化檢測腹主動脈取血后，摘取大鼠腎臟，切取部分腎組織以4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、5 μm厚切片，梯度乙醇脫水，按試劑盒說明進行Masson染色，鏡下觀察腎組織膠原纖維水平。取腎組織，制取10%組織勻漿，ELISA法測定腎組織I型和III型膠原含量，定量分析腎臟纖維化水平。

2.4Westernblot檢測取腎組織，RIPA 裂解液(含磷酸酶和蛋白酶抑制劑)裂解組織，12 000×g、4 ℃離心10 min后收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜、5%脫脂牛奶封閉，分別加入TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad7和β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，ECL發光顯色，凝膠圖像分析儀分析目的條帶光密度，結果以p-Smad2/Smad2或TGF-β1/β-actin、Smad7/β-actin表示。

3 結果

3.1SalB對糖尿病大鼠BUN、UAlb、SCr的影響由Tab 1可見，糖尿病大鼠BUN、SCr和UAlb水平均明顯高于正常對照組(P<0.01)，說明糖尿病大鼠出現明顯腎功能損害。給予Sal B能明顯降低糖尿病大鼠BUN、SCr和UAlb水平(P<0.05，P<0.01)，提示Sal B可有效改善糖尿病大鼠腎功能損害。

Tab 1 Effect of Sal B on BUN, UAlb and SCr in diabetic rats n=7～8)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.2SalB對糖尿病大鼠腎纖維化的影響Fig 1的Masson染色結果顯示，正常組大鼠腎組織細胞間隙清晰可見，腎間質膠原纖維分布極少，染色較淡。而糖尿病模型組大鼠腎小球系膜基質增多，腎間質膠原組織增多，細胞間質有明顯藍色深染的膠原纖維。與模型組相比，Sal B各組大鼠腎組織膠原染色均明顯較少。

Fig 1 Effect of Sal B on renal fibrosis (Masson staining×400)

A: Control group; B: Model group; C: Sal B 80 group; D: Sal B 160 group.

為了定量分析Sal B對糖尿病大鼠腎纖維化的影響，本研究又檢測了大鼠腎組織膠原蛋白含量。如Tab 2所示，模型組大鼠腎組織I型和III型膠原蛋白含量均明顯高于正常對照組(P<0.01)，而給予Sal B可明顯減少腎組織膠原蛋白沉積(P<0.05，P<0.01)，這一結果與Masson染色結果一致。提示Sal B可明顯改善糖尿病大鼠腎纖維化，減少腎組織膠原蛋白沉積。

Tab 2 Effect of Sal B on renal contents of type Ⅰ and type Ⅲ

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.3SalB對腎組織TGF-β1、Smad7蛋白水平及Smad2磷酸化的影響如Fig 2所示，與正常對照組相比，糖尿病大鼠腎組織TGF-β1蛋白水平和Smad2磷酸化水平均明顯升高(P<0.01)，而Smad7蛋白水平則明顯降低(P<0.01)。給予Sal B可明顯降低TGF-β1和磷酸化Smad2蛋白水平，而Smad7蛋白水平則明顯升高(P<0.05，P<0.01)。這一結果與Sal B改善糖尿病大鼠腎臟纖維化作用一致，提示Sal B降低腎組織膠原沉積與調節TGF-β1/Smad信號通路有關。

Fig 2 Effect of Sal B on protein levels of TGF-β1,

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3.4SalB對血清TAC、SOD和MDA水平的影響由Tab 3可見，與正常對照組相比，模型組大鼠血清TAC和SOD水平明顯降低，而MDA水平則明顯升高(P<0.01)，提示糖尿病誘發了明顯氧化應激狀態。給予Sal B后，血清TAC和SOD水平明顯升高，MDA水平明顯下降(P<0.05，P<0.01)，說明Sal B可有效改善糖尿病大鼠氧化應激狀態。

Tab 3 Effect of Sal B on serum levels of TAC, SOD and

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

4 討論

糖尿病腎病的主要病理特征是腎小球硬化和腎小管間質纖維化，表現為腎小球基底膜增厚和腎小管間質膠原蛋白等細胞外基質過度沉積[2]。隨著病情的不斷發展，腎臟組織結構破壞并形成瘢痕組織，腎單位逐漸減少，腎功能呈進行性下降，并最終發展為終末期腎衰竭。因此，有效抑制腎纖維化成為阻止或延緩糖尿病腎病發展進程、改善糖尿病預后的重要措施之一。本研究分別采用Masson染色和ELISA法檢測了大鼠腎臟纖維化水平，結果顯示，糖尿病大鼠出現了明顯腎纖維化，表現為腎組織膠原纖維染色加深，腎組織I型和III型膠原蛋白含量增加，而給予Sal B可明顯減輕糖尿病大鼠腎纖維化，同時受損的腎功能也明顯改善，提示Sal B可能有助于臨床減輕或延緩糖尿病腎病腎纖維化、改善糖尿病預后。

近年來研究發現，TGF-β1/Smad信號通路的異常激活是糖尿病腎病腎纖維化發生發展的主要機制，抑制TGF-β1/Smad信號通路可有效減輕糖尿病大鼠腎纖維化，改善腎功能[7]。TGF-β1是TGF-β超家族一員，廣泛參與纖維化、炎癥及自身免疫性疾病等多種病理過程，是介導腎小球硬化和腎間質纖維化的關鍵細胞因子[8]。TGF-β1既可趨化并活化炎性細胞，促進成纖維細胞增殖和細胞外基質合成，又可抑制細胞外基質降解而促進組織纖維化[9]。Smad蛋白是TGF-β1信號轉導最重要的下游蛋白和效應分子，是TGF-β1信號從細胞表面受體傳至胞核的關鍵因子[9]。Smad蛋白家族分為受體活化型Smad(Smad2、Smad3)、共同通路型Smad(Smad4)和抑制型Smad(Smad6、Smad7)。當TGF-β1與其受體TβRII結合后，活化的TβRII可磷酸化TβRI，并激活其激酶活性，后者進而磷酸化Smad2/3?；罨腟mad2/3與Smad4形成復合物進入胞核，調控I、III型膠原等靶基因轉錄。Smad6/7可直接與TβRI結合，抑制其對Smad2/3的磷酸化作用[9]。本研究結果顯示，糖尿病大鼠腎組織TGF-β1/Smad信號通路明顯激活，表現為TGF-β1和p-Smad2水平均明顯升高，而Smad7水平明顯下降。給予Sal B可明顯減少TGF-β1和p-Smad2水平，上調Smad7蛋白水平，說明Sal B可有效抑制糖尿病大鼠腎組織TGF-β1/Smad信號通路活化，這一結果與前期報道Sal B抑制肺成纖維細胞和腎小球系膜細胞TGF-β1/Smad信號通路活化作用一致[10-11]，提示Sal B改善糖尿病大鼠腎纖維化與抑制TGF-β1/Smad信號通路活化有關。

此外，氧化應激也是糖尿病腎病腎纖維化的重要因素之一[12]。長期高血糖一方面可增加機體活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產生，另一方面可損傷機體抗氧化防御體系，誘導氧化應激狀態，導致氧化損傷[13]。本研究結果顯示，糖尿病大鼠血清抗氧化能力明顯下降，而氧化損傷標志物MDA水平則明顯升高，提示糖尿病大鼠出現了明顯氧化應激狀態。腎臟是對氧化應激損傷比較敏感的器官之一，ROS可通過多種途徑促進糖尿病腎病腎纖維化的發生、發展[13-14]，如激活TGF-β1/Smad信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路，導致腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉化，合成大量細胞外基質。ROS還可影響細胞外基質降解，促進纖維化的發生、發展。大量研究表明，補充抗氧化劑可有效提高機體抗氧化能力，減輕糖尿病腎病腎纖維化[15]。本研究也顯示，補充Sal B可明顯提高糖尿病大鼠血清抗氧化能力，降低氧化損傷標志物血清MDA水平，說明Sal B可明顯改善糖尿病大鼠氧化應激狀態，提示Sal B減輕糖尿病大鼠腎纖維化與其改善氧化應激狀態也有關。

綜上所述，Sal B可明顯改善糖尿病大鼠腎纖維化，改善腎功能，其機制與改善氧化應激狀態、調控TGF-β1/Smad信號通路有關。

(致謝：本研究在皖南醫學院中藥藥理三級實驗室完成，在此對實驗室全體工作人員表示感謝。)