白芍提取物對經前期綜合征肝氣逆證模型大鼠海馬中雌激素β受體及5-羥色胺轉運體的影響

王杰瓊,孫文君,田 溪,李薈好,孫 亞,王 帥，郜彥鑫

(山東中醫藥大學1. 藥學院、2.中醫學院、3.中醫基礎理論研究所，山東 濟南 250355)

經前期綜合征(premenstrual syndrome，PMS)系指育齡期女性在月經黃體期，周期性出現的軀體、精神和行為三方面癥狀的癥候群，屬情志病癥范疇。PMS 肝氣逆證是其主要亞型之一，以肝疏泄太過、經前煩躁易怒為主要特征[1],并且“經前出現，經后消失”是該病癥典型特點。白芍是促進肝主疏泄，維持正常情志活動的要藥。課題組前期研發復方藥物白香丹膠囊能有效改善PMS肝氣逆證主證煩躁易怒，其中白芍提取物為其君藥[2]，但是該藥在PMS肝氣逆證治療中的作用機制尚不清晰。

蘇巧榮等[3]指出，雌激素受體(estrogen receptor，ER)主要是通過5-羥色胺(serotonin, 5-HT)能系統發揮對情緒的調節作用，中樞5-HT活性降低時，機體對應激刺激的敏感性增加，從而引起抑郁或焦慮等負性情緒[4]。Jantarima等[5]發現，雌二醇(estradiol,E2)可通過上調5-羥色胺轉運體(serotonin transporter,SERT) mRNA表達，提高5-HT能系統成分含量及轉化率，達到治療去卵巢大鼠焦慮樣情緒的目的。另有研究報道，海馬在情緒調節及相關情志疾病發病機制中占有重要地位。因此，本研究選擇海馬作為研究對象，探討白芍提取物對PMS肝氣逆證模型大鼠ERβ及其介導的5-HT能系統中SERT的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物Wistar大鼠，♀，150只，體質量150～180 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供, 許可證號：SCXK(京)2007-0001。晝夜顛倒(早9:00關燈，晚9:00開燈)適應性飼養1周。

1.2試劑白芍提取物由青島海川創新生物天然藥物研究中心提供，芍藥苷含量35%；鹽酸氟西汀膠囊(禮來蘇州制藥有限公司，國藥準字J20130010)；ERβ激動劑diarylpropionitrile(DPN)(ab120166)、ERβ兔多克隆一抗(ab3577)、SERT兔多克隆一抗(ab44520)，均購于Abcam公司；FITC標記山羊抗兔IgG(H+L)(A0562，上海碧云天生物技術有限公司)；TRIzol總RNA提取試劑盒(SK1322，上海生工公司)；Oligod(T)18 primers (D511，TaKaRa公司)；M-MLV試劑盒(D2639A，TaKaRa公司)。

1.3PMS電刺激大鼠模型制備

1.3.1曠場實驗[6]本實驗采用陰道涂片法篩選動情周期規律大鼠納入實驗。造模前后，采用50 cm×50 cm×40 cm曠場箱和Xmaze動物行為分析系統，記錄大鼠3 min內的活動總路程。

1.3.2動物分組造模及給藥 將60只合格大鼠，據曠場總路程和大鼠體質量隨機分為5組：正常對照組、PMS肝氣逆模型組、氟西汀對照組、ERβ激動劑DPN給藥組、白芍提取物給藥組。造模方法如下：除正常組外，其他各組大鼠均置于ST-A數字脈沖生物刺激儀。電壓2 700～3 300 V，脈寬0.3 s，脈沖間隔為白天5 min，夜晚10 min，持續5 d，造模過程中除正常組、模型組同時給予生理鹽水外，其余各組給予相應藥物。

各組給藥情況如下：正常組及模型組給予生理鹽水，白芍提取物組灌胃劑量為40 mg·kg-1·d-1[7]；氟西汀組給藥劑量2.67 mg·kg-1·d-1；激動劑組大鼠皮下注射ERβ激動劑DPN(DPN 40 mg溶于1 mL DMSO渦旋震蕩溶解后，再加入19 mL 25% DMSO配制成2 g·L-1DPN溶液)，給藥劑量2 mg·kg-1·d-1，各組給藥時間5 d，每天1次。于末次給藥后30 min,采用陰道涂片確定動情周期，其中每組6只大鼠用于海馬ERβ和SERT mRNA表達測定，另外6只用于海馬組織ERβ和SERT的分布和蛋白表達測定。

1.4海馬ERβ和SERTmRNA表達測定各組大鼠斷頭取腦，繼而分離海馬組織，立即放入液氮罐中，儲存于-70 ℃。采用TRIzol 法提取總RNA。取1 μg總RNA，按1 μg/20 μL反應體系逆轉錄合成 cDNA，擴增條件: 94 ℃ 150 s,預變性；94 ℃ 30 s，變性；(ERβ：61.6 ℃ 40 s；SERT：61 ℃ 40 s；β-actin:59 ℃ 40 s )復性；72 ℃ 1 min延伸；72 ℃ 7 min，再延伸。之后，取8 μL cDNA產物，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳(含1%綠如藍DNAgreen)電泳，電壓120 V，時間30 min。以目的基因/β-actin為mRNA相對表達量，進行半定量分析。參照 Gene Bank大鼠基因序列合成ERβ、SERT和β-actin引物，引物序列見Tab 1[8]。

Tab 1 Primer sequence and product size of ERβ and SERT

1.5海馬中ERβ和SERT分布狀態及蛋白表達各組大鼠用1%戊巴比妥鈉(4 mL·kg-1)麻醉,心臟灌流后取全腦，置于4%多聚甲醛中4 ℃封閉。1周后，進行石蠟包埋，切片(厚約5 μm，切片角度5°)。脫蠟、修復后，滴加正常山羊血清封閉工作液50 μL，室溫反應30 min。將ERβ和SERT一抗稀釋液50 μL于目標切片上進行孵育，避光滴加FITC標記山羊抗兔IgG二抗50 μL，37 ℃孵育30 min，0.01 mol·L-1PBS漂洗3次，每次5 min，隨后避光滴加抗熒光衰減封片劑，封片4 ℃保存。利用激光共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司,LSM510型)觀察ERβ和SERT在海馬CA1、CA3區的分布及表達。每張切片選取3個視野。使用Image-Pro Plus6.0分析數據，并計算相對熒光強度(relative mean fluorescence intensity, RMFI)，RMFI=積分光密度(IOD)/圖片總面積(area)。

1.6數據處理利用統計軟件GraphPad Prism 6進行數據處理，組間比較采用One-way ANOVA檢驗。

2 結果

2.1曠場行為學結果如Fig 1所示，與正常組相比，模型組大鼠自主活動頻繁，總路程明顯上調(P<0.01)；與模型組相比，白芍提取物干預后，大鼠自主活動趨于正常，總路程明顯下調(P<0.05)，與氟西汀和ERβ激動劑組表達一致。

Fig 1 Total distance of rats in each group

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

2.2大鼠海馬SERT、ERβmRNA的表達如Fig 2所示，與正常組相比，大鼠接受期，各組大鼠中樞海馬ERβ、SERT mRNA表達均無明顯變化(P>0.05)。在非接受期，PMS肝氣逆證模型大鼠中樞海馬ERβ mRNA表達明顯下調，SERT mRNA表達明顯上調(P<0.01)；白芍提取物干預后，明顯上調ERβ mRNA表達，下調SERT mRNA表達(P<0.05)，并且與氟西汀和ERβ激動劑組表達一致。

2.3大鼠海馬CA1、CA3區SERT、ERβ的蛋白表達分布如Fig 3所示，大鼠接受期，與正常組和模型組比較，各組大鼠海馬CA1、CA3區錐體細胞多為圓狀或點狀，排列緊密，差異均有顯著性；ERβ、SERT的RMFI差異無顯著性(P>0.05)。大鼠非接受期：與正常組比較，模型組大鼠海馬CA1、CA3腦區錐體細胞排列不規則，ERβ陽性細胞數和RMFI均明顯下降(P<0.01，P<0.05)；SERT陽性細胞數和RMFI均明顯升高(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，白芍提取物干預后細胞形態趨于正常，ERβ的RMFI明顯升高(P<0.01，P<0.05)，SERT的RMFI明顯下降(P<0.01，P<0.05)，并且與氟西汀和ERβ激動劑組表達一致，差異無顯著性。

3 討論

PMS發病機制復雜,目前5-HT作為該病癥腦內重要的單胺類神經遞質成為研究熱點之一，SERT作用于5-HT轉運過程，對腦內5-HT水平起到調控作用。動物遺傳學的研究結果證實，腦內單胺轉運蛋白的功能與行為學表現及情緒狀態密切相關。完全喪失SERT功能的基因敲除小鼠表現出5-HT綜合征樣行為、焦慮抑郁樣行為、焦慮抑郁樣癥狀及社交障礙[9]。

諸多研究表明，ER對情緒沒有直接調節作用，而是通過5-HT能系統與GABA能系統間接實現的。5-HT能系統中SERT主要功能是將5-HT轉運到腦及外周組織的相關受體而發揮作用，因此，SERT功能異常會導致5-HT及其受體相應功能異常，進而出現焦慮、恐懼、抑郁等消極情緒障礙。有研究顯示，ERβ基因敲除小鼠易煩躁易怒、焦慮不安[10]。Walf等[11]研究發現，雌激素可作用于海馬和杏仁核的細胞內ER，發揮抗焦慮的作用。也有文獻報道[12]，雌激素可調節海馬CA1區突觸發生。另有研究發現[13]，雌激素可引起去卵巢恒河猴SERT mRNA在中縫背核的表達明顯下降，SERT mRNA陽性細胞的數量也明顯減少。因此，說明雌激素及其受體能夠介導5-HT能系統功能。

本研究采用改進的情志刺激為主的多因素造模法，主要通過電刺激復制PMS肝氣逆證大鼠模型，將非接受期大鼠置入可調式電刺激籠內，在減少電擊造成的軀體傷害的同時加強心理性應激[14]，利于模型的成功復制。曠場實驗可用來評判動物焦慮和抑郁狀態[15]。本研究結果顯示，大鼠在非接受期，模型組活動總路程明顯升高，說明PMS肝氣逆證模型大鼠表現出焦慮樣行為。給予白芍提取物后，活動總路程明顯較少，說明白芍提取物可明顯改善PMS肝氣逆證引起的負性情緒。

基因檢測結果顯示，大鼠動情接受期，各類指標并無明顯變化。在非接受期，PMS肝氣逆證模型大鼠海馬ERβ mRNA表達明顯降低，SERT mRNA明顯上調；海馬CA1、CA3區錐體細胞排列雜亂，ERβ 陽性細胞數目減少，RMFI明顯下降，SERT陽性細胞數目增多，RMFI明顯升高，給予白芍提取物后的細胞形態趨于正常。以上研究結果與本研究所得模型大鼠海馬區ERβ mRNA和蛋白表達均明顯下降，SERT mRNA和蛋白表達升高均一致。提示白芍提取物可能具有雌激素樣作用，或者能夠通過改善中樞海馬ERβ的功能，繼而糾正5-HT能系統中SERT的功能，最終起到調整PMS肝氣逆證煩躁易怒等主要癥狀的作用。

Fig 2 Expression of ER and SERT mRNA in hippocampus of rats at both estrous receptive(A) and non-receptive

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel;1：Control;2:Model;3:Paeonifiorin extract;4:Fluoxetine;5:ERβ agonist

綜上所述，采用情志刺激為主多因素造模法可以成功制備PMS肝氣逆證大鼠模型，模擬PMS主要特征“經前出現，經后消失”。通過該模型的研究，初步證明PMS肝氣逆證的發病機制可能與大鼠海馬ERβ、SERT的蛋白表達和mRNA的改變有關。白芍提取物有可能發揮雌激素樣作用，通過改善海馬區ERβ 和SERT的表達，起到調節PMS肝氣逆證負性情緒的作用。但是白芍提取物雌激素樣作用及其具體機制尚需進一步探討。

(本實驗是在山東中醫藥大學中醫基礎理論研究所完成，感謝該研究所及情志病證創新研究團隊所有同仁的支持和幫助)