SNP 分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)作物種子檢測(cè)中的研究與應(yīng)用

李巧英 鄭戈文

（山西省農(nóng)業(yè)種子總站，太原 030006）

農(nóng)作物種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵要素，種子質(zhì)量的優(yōu)劣決定著國家農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，決定著人民的溫飽問題。種子質(zhì)量檢測(cè)是掌握種子好壞的一個(gè)重要手段，通過檢測(cè)活動(dòng)了解種子的一些特性及遺傳信息，從而進(jìn)行種子的繁育、生產(chǎn)及調(diào)配。隨著農(nóng)作物種子品種數(shù)目增加，品種之間親緣關(guān)系越來越緊密，依靠傳統(tǒng)的方法和蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)已經(jīng)不能很明確地區(qū)分各品種，分子標(biāo)記方法實(shí)現(xiàn)了從DNA 水平上鑒別品種，能很好地區(qū)分親緣關(guān)系較近的品種，并且通過分子檢測(cè)能夠了解各品種之間的遺傳關(guān)系，因此受到了大家的青睞，同時(shí)也是種子檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的需要。

分子標(biāo)記技術(shù)是近年來發(fā)展比較快的一種技術(shù)，第1 代分子標(biāo)記和第2 代分子標(biāo)記方法在種子質(zhì)量檢測(cè)中發(fā)揮了必不可少的作用，但是隨著分子標(biāo)記技術(shù)不斷地推廣應(yīng)用，也遇到了一些問題，如試驗(yàn)可重復(fù)性差，數(shù)據(jù)整合較困難，大量種子檢測(cè)工作任務(wù)繁重等。經(jīng)過不斷地研究改進(jìn)，1996 年美國學(xué)者Eric S.Lander 正式提出了第3 代分子標(biāo)記技術(shù)——SNP[1]，它是在SSR、ISSR 第2 代分子標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種標(biāo)記技術(shù)。SNP 是基于PCR 技術(shù)的一種標(biāo)記方法，由于其分布均勻廣泛，具有可遺傳性，穩(wěn)定性較高，并且有效地改進(jìn)了第1 代、第2 代分子標(biāo)記方法的缺陷，近年來在農(nóng)作物種子檢測(cè)中被廣泛研究和應(yīng)用，主要用于玉米、水稻、小麥、棉花、大豆等農(nóng)作物種子的真實(shí)性檢測(cè)、純度檢測(cè)和遺傳圖譜、指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建等方面。

1 SNP 分子標(biāo)記技術(shù)及其特點(diǎn)

SNP（Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）是指不同生物個(gè)體在基因組DNA 序列中單個(gè)核苷酸的差異，即在生物不同品種的個(gè)體間染色體上存在單個(gè)堿基的差異，是由于基因序列中某個(gè)位置的單個(gè)堿基插入、缺失、轉(zhuǎn)換和顛倒造成的，這種差異就作為SNP 分子標(biāo)記。

SNP 分子標(biāo)記的本質(zhì)是DNA 單堿基變異，與第1 代標(biāo)記RFLP、第2 代標(biāo)記SSR 的主要不同之處，RFLP、SSR 是以DNA 序列片段作為標(biāo)記，SNP 是以單個(gè)堿基的變化作為標(biāo)記。SNP 標(biāo)記技術(shù)通過檢測(cè)分析染色體上某個(gè)位置單個(gè)核苷酸的差異，可以實(shí)現(xiàn)區(qū)分不同個(gè)體遺傳物質(zhì)的差異，從而辨別不同的品種。SNP 基因分型就是用特異性的引物對(duì)某一段基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)單堿基延伸，獲得SNP信息，通過不同技術(shù)平臺(tái)（主要包括基因芯片技術(shù)、Taqman 技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)和焦磷酸測(cè)序法等）檢測(cè)出SNP位點(diǎn)信息，與對(duì)照樣品進(jìn)行比對(duì)區(qū)分品種。

SNP 分子標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：?jiǎn)魏塑账嶙儺悾植紡V泛均勻，數(shù)量多，遺傳穩(wěn)定性高，具有代表性，通量高，檢測(cè)快，可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，易于標(biāo)準(zhǔn)化操作，數(shù)據(jù)整合更簡(jiǎn)捷，適合大規(guī)模樣品SNP 檢測(cè)研究與應(yīng)用；它的缺點(diǎn)是：錯(cuò)誤信號(hào)多，易發(fā)生假陽性，檢測(cè)成本高，同時(shí)要求在該物種全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上進(jìn)行，并要求操作人員有一定的分子生物學(xué)理論基礎(chǔ)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

2 SNP 分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)作物種子質(zhì)量檢測(cè)中的應(yīng)用

SNP 分子標(biāo)記技術(shù)由于試驗(yàn)重復(fù)性好、覆蓋面廣，結(jié)果易判定，且實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)比對(duì)更容易，近年來在種子質(zhì)量檢測(cè)中越來越受到大家的重視。

2.1 SNP 分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于種子真實(shí)性檢測(cè)種子真實(shí)性是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，是指一批種子的特性，其所屬品種、種或?qū)倥c文件記錄（該品種審定時(shí)所描述的內(nèi)容）是否一致，即品種是否名副其實(shí)。種子真實(shí)性就是解決種子的身份問題，甲品種是不是甲，有沒有被假冒，如果甲品種的種子冒充乙品種，可能會(huì)引起市場(chǎng)混亂、延誤農(nóng)時(shí)，或不適應(yīng)播種地的氣候條件、產(chǎn)生病害或者造成減產(chǎn)。種子真實(shí)性檢測(cè)就是通過檢驗(yàn)種子身份，了解種子的特性，使各品種因地制宜發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用SNP 分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)種子真實(shí)性，更加快速高效。李雪等[2]比較SSR 和SNP 標(biāo)記方法在玉米種子真實(shí)性鑒定中的應(yīng)用，選擇了11 套玉米種子雜交種和親本進(jìn)行試驗(yàn)，用40 對(duì)SSR 引物和3072 個(gè)SNP 位點(diǎn)的數(shù)據(jù)，比較分析各個(gè)參數(shù)，結(jié)果表明，這2 種方法在種子真實(shí)性鑒定方面具有較好的一致性；陸靜姣等[3]用SNP 標(biāo)記對(duì)南方104 個(gè)秈型兩系雜交水稻親本進(jìn)行遺傳差異性研究，發(fā)現(xiàn)SNP 標(biāo)記分析的水稻品種間遺傳差異與系譜分析結(jié)果一致性很高；陳廣鳳等[4]通過SNP 分子標(biāo)記方法，對(duì)中國冬麥區(qū)205 份小麥育成品種進(jìn)行基因分型，研究小麥遺傳多樣性。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，SNP 標(biāo)記方法檢測(cè)種子真實(shí)性，在品種區(qū)分能力、位點(diǎn)穩(wěn)定性及遺傳關(guān)系分析等方面簡(jiǎn)捷有效，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2 SNP 分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于種子純度檢測(cè)種子純度是一個(gè)品種在特征特性方面典型一致的程度，不同品種在外觀表現(xiàn)及田間生長(zhǎng)特性等方面有很大差異，種子純度檢測(cè)通常采用田間小區(qū)種植鑒定和蛋白質(zhì)電泳方法。田間小區(qū)種植鑒定受自然環(huán)境條件和人為主觀因素的影響，不能保證檢測(cè)結(jié)果的及時(shí)性和準(zhǔn)確性；蛋白質(zhì)電泳方法檢測(cè)受親緣關(guān)系遠(yuǎn)近和遺傳基礎(chǔ)條件的影響不能明確鑒別出異品種。利用SNP 標(biāo)記方法進(jìn)行種子純度檢測(cè)，可以從分子水平上鑒定種子特性的一致性，結(jié)果準(zhǔn)確且效率高。吳明生等[5]利用1 個(gè)多態(tài)性SNP 位點(diǎn)，分析5 個(gè)雜交玉米組合，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)可以將其中2 個(gè)雜交玉米品種中混雜的親本區(qū)分出來，結(jié)果準(zhǔn)確；匡孟等[6]基于KASP 技術(shù)，利用SNP 標(biāo)記方法，從63K的棉花全基因組芯片中，選出26 個(gè)雜合率高且分型效果理想的SNP 核心位點(diǎn)，進(jìn)行棉花雜交種純度檢測(cè)；蘭青闊等[7]經(jīng)試驗(yàn)篩選出SNP 位點(diǎn)CLA6（A/G），結(jié)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)，建立黃瓜雜交種純度鑒定方法，研究結(jié)果與SSR 方法鑒定結(jié)果一致。金名捺等[8]利用水稻全基因組9K SNP 芯片對(duì)栽培稻品種黃華占和野生稻Y605 進(jìn)行掃描，尋找兩者之間的SNP 位點(diǎn)，并將其開發(fā)成基于HRM 技術(shù)的特異分子標(biāo)記。利用這些標(biāo)記對(duì)黃華占與野生稻Y605的BC3F1和BC3F2群體進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)它們都能準(zhǔn)確區(qū)分親本的純合與雜合基因型。研究表明，SNP 標(biāo)記方法檢測(cè)種子純度，克服了環(huán)境和人員因素的影響，能從DNA 水平上將親緣關(guān)系較近的和遺傳關(guān)系復(fù)雜的異品種明確地辨別出，并且適合大量樣本的檢測(cè)，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.3 SNP 分子標(biāo)記技術(shù)在其他方面的應(yīng)用目前SNP 分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)作物品種遺傳圖譜、數(shù)據(jù)庫構(gòu)建等方面的研究應(yīng)用非常廣泛，在小麥、油菜、大豆、甘藍(lán)等作物中均有報(bào)道。高尚等[9]用90K SNP 基因芯片技術(shù)，對(duì)包含188 個(gè)家系的小麥群體進(jìn)行分析，構(gòu)建小麥高密度遺傳圖譜；趙仁欣等[10]通過SNP 芯片分析224 份國家甘藍(lán)型油菜品種，用60K SNP 芯片進(jìn)行基因分型，篩選得到5374 個(gè)SNP 標(biāo)記，且這些標(biāo)記在油菜全基因組上分布均勻、多態(tài)性高、區(qū)分度好，用于構(gòu)建甘藍(lán)型油菜品種DNA 指紋圖譜；譚瑞娟等[11]通過50 個(gè)多態(tài)性SNP 標(biāo)記位點(diǎn)，研究分析不同的大豆品系，構(gòu)建大豆基因組遺傳圖譜；李志遠(yuǎn)等[12]利用SNP 標(biāo)記分析59 個(gè)甘藍(lán)品種，篩選出417個(gè)在染色體上均勻分布、多態(tài)性較好的SNP 位點(diǎn)，作為構(gòu)建DNA 指紋圖譜的核心標(biāo)記，獲得甘藍(lán)品種SNP 指紋圖譜。遺傳圖譜的構(gòu)建為鑒定分析農(nóng)作物品種的真實(shí)性、特異性提供了依據(jù)。我國農(nóng)作物品種SNP 指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建正在進(jìn)行中，玉米、水稻、小麥、棉花等農(nóng)作物種子的數(shù)據(jù)庫信息在不斷完善中，油菜、番茄、辣椒等蔬菜種子的信息也在收集整理中。SNP 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行農(nóng)作物種子質(zhì)量檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)正在陸續(xù)制訂與頒布，已經(jīng)頒布的有NY/T 2745-2015《水稻品種鑒定 SNP 標(biāo)記法》。

3 展望

在分子生物技術(shù)迅猛發(fā)展的時(shí)代，分子標(biāo)記技術(shù)推陳出新，SNP 標(biāo)記作為新一代的標(biāo)記方法，具有更多的技術(shù)特點(diǎn)，集合了DNA 提取程序化、電泳分析自動(dòng)化、數(shù)據(jù)整合標(biāo)準(zhǔn)化，與數(shù)據(jù)庫信息比對(duì)，分析速度更快、信息更全面、結(jié)果更可靠。隨著SNP技術(shù)的研究與探索，檢測(cè)技術(shù)和分析手段不斷地改進(jìn)與完善，特異性引物的開發(fā)與共享，假陽性、高成本等問題的解決，SNP 技術(shù)在種子質(zhì)量檢測(cè)的推廣應(yīng)用中，將會(huì)發(fā)揮更大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，極大地提高檢測(cè)工作效率，為保障農(nóng)民用種安全，維護(hù)企業(yè)合法權(quán)益，確保種子市場(chǎng)健康有序提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。