液體活檢在頭頸鱗癌中的研究和應用

張依楠，李夢瑋，李 鑫，徐寒梅

隨著精準醫學和個體化治療在腫瘤領域的發展，出現了采用腫瘤分子生物學特征進行檢測的需求。液體活檢技術克服了傳統組織活檢的高侵入性、取樣困難和難以實時監測等局限性，使腫瘤的實時動態監測成為可能。液體活檢技術以無創、快捷、可重復等特點得到了廣泛關注，在未來有巨大的發展潛力。頭頸鱗癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)是常見的癌癥之一，嚴重影響患者的生活質量和生存期。作者對液體活檢在HNSCC中的研究和應用作一綜述。

1 頭頸癌與液體活檢

頭頸部腫瘤是世界上常見的癌癥之一，其中HNSCC占90%以上[1]。頭頸癌包括起源于唇、口腔、鼻腔、副鼻竇、咽和喉等部位的腫瘤。此疾病可使患者產生生理缺陷，嚴重影響生活質量。不同部位的腫瘤，發病誘因不盡相同。鼻咽癌主要由Epstein-Barr病毒引起，而口咽癌主要由人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的HPV-16和HPV-18致癌型感染引起。在全球范圍內，HPV-16引起的口腔癌發病率最高的國家是中國(81%)，然后分別是印度(74%)、荷蘭(63%)、西班牙(47%)、英國(20%)和美國(20%)[2]。HNSCC的發病機制與飲酒、吸煙和高危HPV感染密切相關，其中吸煙者患病的可能性比不吸煙者高10倍[3]。

乳腺癌的5年相對生存率為89%，膀胱癌為77%，結直腸癌為65%,皮膚癌為92%[4]。而頭頸癌患者從診斷出疾病到死亡的中位生存時間為1～12個月。患者5年總體生存率為50%左右[1]。頭頸癌的高死亡率與診斷較晚和轉移有關。大多數患者被診斷為局部晚期疾病，頭頸癌遠處轉移傾向于肺部(66%)、骨骼(22%)、肝臟(10%)、皮膚(>2%)、縱隔(>2%)和骨髓(>2%)等[2]。

成像技術和腫瘤組織活檢是目前頭頸癌診斷的常用方法。其中成像技術包括磁共振成像、電子計算機斷層掃描以及正電子發射型計算機斷層顯像等。對于難以進入的部位，通常使用超聲引導的細針抽吸器對該部位進行取樣[5]。患者主要采用手術、放療和化療相結合的治療方式。然而現有的圖像技術仍不能滿足對腫瘤早期轉移和預后監測的需求；腫瘤組織活檢存在著取樣困難、只有一個樣本無法顧及腫瘤異質性、多次取樣成本較高、容易造成患者面部毀容等缺陷。因此，迫切需要一種侵入性較小的檢測方式來監測患者腫瘤的發生和遠處轉移，從而提高患者的生存率。

液體活檢是指用體液樣本代替腫瘤組織進行病理學、分子生物學、免疫學等方面的檢測，從而獲取疾病信息，幫助疾病的診斷和治療。液體活檢的檢測對象包括血液、唾液等體液中的循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)、循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、腫瘤細胞來源的外泌體等。液體活檢具有微創、自動化完成、可重復、減小腫瘤異質性干擾等優點[6-8]。

2 CTCs與HNSCC

1869年，Ashworth[9]首次發現了腫瘤患者體內存在CTCs，他在血液中檢測到了形態異常的細胞，并認為它們來自腫瘤組織，因為它們與實體腫瘤細胞具有相同的形態特征。CTCs是來源于腫瘤組織，可通過主動脫落或被動的上皮-間質轉化過程脫落后進入血液循環中的腫瘤細胞。大部分CTCs被機械因素和免疫系統破壞，只有極少部分的CTCs存活下來進入循環系統[10]。進入血液循環的未被清除的腫瘤細胞通過遷移、粘附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發展為轉移灶[11]。CTCs是惡性腫瘤患者出現術后復發和遠處轉移的重要原因，也是導致腫瘤患者死亡的重要因素[12]。CTCs與腫瘤轉移及預后的相關性越來越受到人們的關注。

2.1 CTCs及其檢測 1 mL的血液攜帶大約10億紅細胞、700萬白細胞和2.95億血小板[13]。這對CTCs檢測技術的靈敏度和精確度提出了很高的要求。現有多種檢測CTCs的方法，包括聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)、流式細胞術、微流控芯片、免疫磁性富集法和激光掃描細胞術等。

一種廣泛使用的CTCs檢測方法是利用細胞標志物來識別。基于此原理，科學家研究出了CellSearch系統[14]。該方法將腫瘤細胞固定并富集在磁珠上，隨后通過熒光染料標記細胞核，具有EpCAM+、CK+、DAPI+、CD45-的細胞被界定為CTCs。CellSearch系統自動化程度較高、可同時處理多個樣本，并且將免疫熒光標記與免疫磁珠分選富集技術結合在一起，有較高的敏感性、可重復性及特異性[15-16]。2004年，此系統被美國食品和藥品監督管理局批準用于臨床，是一種標準化的檢測方法。該方法已開始用于檢測轉移性乳腺癌、結直腸癌及前列腺癌患者的CTCs[14]。已有CellSearch系統應用于頭頸癌相關研究的報道，EpCAM在口咽癌和喉癌中的表達率為22%～75%，在唾液腺癌中的表達率為83%～100%。CellSearch系統能夠以EpCAM陽性細胞的免疫磁性富集為基礎從血液中分離頭頸癌細胞[15-16]。

Morgan等[17]采用了一種新方法，使用表面增強拉曼光譜散射(surface-enhanced Raman scattering，SERS)納米技術在白細胞存在的情況下檢測目標CTCs。其原理是使用帶有表皮生長因子肽的SERS納米粒子作為靶向配體，來檢測在幾乎所有的HNSCC中都有表達的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)，這使檢測的成功率大大提高。SERS技術獨特的檢測模式，使我們省去了繁瑣的分離純化過程，實現了精準檢測。

2.2 CTCs在HNSCC診療中的應用 Morgan等[17]采用SERS納米粒子檢測HNSCC患者外周血中的CTCs，發現預測遠處轉移性疾病進展的最佳臨界點是675CTCs/7.5 mL外周血。CTCs數量≤675時，5年無遠處轉移生存為89%；而CTCs數量>675時，5年無遠處轉移生存為71.4%。Jatana等[18]對48例HNSCC患者研究發現，未檢測到CTCs的患者的無病生存期顯著高于對照組(P=0.01)；所檢出的CTCs越多，無病生存期越差(P=0.04)。然而，Buglione等[19]在一些癌癥中沒有發現CTCs的診斷與患者的生存或腫瘤復發之間的相關性。Van de Stolpe等[20]發現CTCs實際上是高度異質性的，僅用CTCs計數來評估疾病的預后是不準確的。而研究具有侵襲性特征的CTCs亞群則具有重要的臨床意義。

環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)在促進腫瘤細胞增殖、血管新生和侵襲能力，抑制細胞凋亡等方面發揮著重要作用[21]。研究表明，鼻咽癌患者治療后CTCs中COX-2的表達與治療不良反應、更高的腫瘤復發和轉移風險密切相關。如果患者治療后檢測出CTCs中表達COX-2，則為預后總生存期(overall survival，OS)和無進展生存期(progression-free survival，PFS)較低。根據COX-2的表達情況來積極調整臨床治療方案，從而提高鼻咽癌患者生存率[22]。

平足蛋白(podoplanin，PDPN)與EpCAM在CTCs中的表達是HNSCC的預后因素之一。Hsieh等[23]隨訪HNSCC患者6.6～18.5個月后發現，若PDPN+/EpCAM+-CTCs>20%是HNSCC患者在6個月內死亡的重要預后因素(P=0.011)，與不良PFS(P=0.016)和OS(P=0.015)相關。PDPN+/EpCAM+-CTCs比率，在臨床上有一定的參考價值。

Strati等[24]研究發現，HNSCC患者在放化療治療結束時，CTCs過度表達程序性細胞死亡蛋白配體-1(programmed death-ligand 1，PD-L1)的患者PFS(P=0.001)和OS較低(P<0.001)。多變量分析顯示，治療結束時PD-L1過度表達是PFS和OS的獨立預后因素。

3 ctDNA與HNSCC

腫瘤細胞凋亡或壞死后將ctDNA釋放到血液中[25]。ctDNA主要來源于原發性腫瘤、CTCs、微轉移灶及轉移灶。ctDNA通過肝臟、腎臟等快速清除，半衰期從16 min到數小時，雖然這帶來檢測上的挑戰，但是能夠反映腫瘤的實時變化狀態。一些ctDNA通過與蛋白結合的形式存在，從而減少了血漿核酸酶對ctDNA的作用，使其避免被快速降解。ctDNA包含與其同源腫瘤細胞相同的基因缺陷，例如點突變、基因重組甚至基因拷貝數的變異等[26]。ctDNA的研究主要是其作為非侵襲性標志物的可能性，以及其表達水平與腫瘤復發轉移的關系[27]。ctDNA水平與腫瘤負荷程度呈正相關，這在腫瘤檢測中得到了很好的應用[28]。

3.1 ctDNA及其檢測 由于ctDNA濃度低而且高度碎片化，因此，要盡量提高分離和富集效率。從血漿中分離和富集ctDNA的方法有吸附柱法和磁珠法。ctDNA檢測主要利用ctDNA突變基因和ctDNA的甲基化[29]。隨著二代測序技術的發展，ctDNA檢測和分析方法發生了巨大變化。用于分析ctDNA的主要方法是通過PCR擴增ctDNA基因靶標，然后進行下游分析。此外有多種方法用于點突變的靈敏檢測，包括實時定量PCR，數字液滴PCR和Sanger測序等。ctDNA的甲基化檢測方法較多，包括高效液相色譜法、甲基化特異性PCR、甲基化間位點擴增等[30]。

Wang等[31]對47例HNSCC患者的研究，發現87%的患者能夠檢測到具有腫瘤特異性點突變的血漿ctDNA。血漿ctDNA檢出率在不同部位腫瘤之間無顯著性差異(口腔80%、口咽91%、喉86%和下咽100%)。而唾液ctDNA檢出率，口腔腫瘤患者(100%)與其他部位腫瘤患者(47%～70%)差異顯著。唾液優先富集來自口腔腫瘤的ctDNA，而血漿則富集來自各個部位的ctDNA。當結合血漿和唾液中脫落的DNA片段檢測結果時，診斷靈敏度提高到96%。將血漿和唾液ctDNA檢測結合起來是提高檢測靈敏度的有效策略。

3.2 ctDNA在HNSCC診療中的應用 目前已發現一些HNSCC唾液和血漿ctDNA的生物標志物，如TP53、PIK3CA、FBXW7、CDKN2A等[32]。Mazurek等[33]發現ctDNA濃度、淋巴結狀態(N0-1對N2-3)、分期(Ⅰ-Ⅲ對Ⅳ)和年齡(<63和>63)之間存在顯著相關性。

ctDNA檢測可發現患者攜帶的腫瘤相關單核苷酸變異、拷貝數改變及結構變異等遺傳學改變。Mydlarz等[34]評估了來自100名HNSCC患者和50名健康體檢者血清DNA甲基化的水平。在10%HNSCC患者的血清中鑒定出內皮素受體B基因高甲基化。血清內皮素受體B基因高甲基化是高度特異性但不敏感的HNSCC血清生物標志物。Schr?ck等[35]通過對141名HNSCC患者血漿中的SHOX2和SEPTIN9 DNA甲基化情況進行量化監控，發現來自血漿的ctDNA中SHOX2和SEPTIN9 DNA甲基化水平是臨床上有價值的生物標志物，敏感性52%、特異性95%。

ctDNA檢測可用于疾病的早期診斷和疾病復發的監測。在一項對47名HNSCC患者的研究中，Wang等[31]發現可檢測到口腔癌患者腫瘤產生的ctDNA，并且75%的口腔癌患者處于癌癥的早期階段(Ⅰ或Ⅱ)；腫瘤的盡早診斷可以為臨床決策提供依據，提高患者的生存率；收集了9例HNSCC患者的術后治療樣本，5例ctDNA陰性患者平均隨訪12個月均無復發，3例ctDNA陽性患者發生了疾病復發；與臨床放射學檢查相比，血漿ctDNA檢測能夠幫助醫生更早發現疾病復發。

4 外泌體與HNSCC

外泌體發現并命名于1986年[36]。外泌體是直徑30～100 nm的囊泡，與質膜融合后釋放到細胞外環境中。外泌體包含多種蛋白質、mRNAs和miRNAs。外泌體被認為具有多種功能，能夠與細胞微環境相互作用，參與了信號傳遞、細胞募集、免疫應答和遺傳物質的轉移等多種生理過程，是一種重要的細胞間物質和信息交流工具[37]。外泌體可由機體中的多種細胞分泌，并廣泛分布于唾液、血漿和乳汁等體液中[38-39]。腫瘤細胞分泌大量外泌體，來與周圍基質組織溝通，激活增殖和血管生成途徑，參與轉移前部位的形成，從而促進腫瘤的發展。因此，外泌體是腫瘤微環境的重要組成部分，目前被認為是促進腫瘤發展和轉移的主要因素之一[37]。

4.1 外泌體分離及其檢測 從細胞培養上清液和不同體液中分離并富集外泌體有多種方法[40]。首先，從體液或細胞培養上清液中通過2 000 r/min離心去除死細胞；然后，在10 000 r/min離心時去除細胞碎片；接著，用含有外泌體的上清液通過200 nm的過濾器將所有尺寸在200 nm以上的較大粒子分離開來；最后，進一步分離純化外泌體，如：超速離心、等密度離心、免疫親和分離、尺寸排阻色譜等[41]。超速離心法以沉降系數為基礎，轉速大于100 000 r/min，分離出外泌體，適用于低成本大量樣品的分離[42]。密度梯度離心采用蔗糖等梯度介質分離外泌體，為蛋白質組學等分析提供了優質材料[41]。

分離后的外泌體可以采用多種分析方法，如：透射電子顯微鏡、流式細胞術、Western Blot等進行完整性、大小、密度、已知陽性標記等方面的檢測[43]。Sharma等[44]利用一種新的、超靈敏的原子力顯微鏡對人唾液外泌體進行了結構力學和生化表征研究。

4.2 外泌體在HNSCC診療中的應用 外泌體在免疫抑制和檢測癌癥進程中發揮著重要的作用。Theodoraki等[45]從HNSCC患者血漿中分離出了攜帶PD-L1的并可以抑制T細胞功能的外泌體。與疾病早期患者相比，疾病晚期患者血漿中有較高的PD-L1+外泌體水平，并且抑制CD8+T細胞活化的能力更強。外泌體攜帶的PD-L1水平與HNSCC患者的疾病進程、分期及淋巴結狀況有關，是反映HNSCC患者疾病和免疫活動的重要指標。

外泌體所攜帶的miRNA也被用于HNSCC的診斷中。Manikandan等[46]比較不同疾病分期的口腔鱗癌患者和口腔良性腫瘤患者血漿中5種外泌體miRNA表達水平，發現早期、晚期口腔鱗癌患者外泌體中miR-29b、miR-142-3p、miR-144、miR-203及miR-223表達水平之間有顯著差異，表明外泌體miRNA的表達水平與口腔鱗癌分期有關。

外泌體miRNAs可成為HNSCC預后的生物標志物。Ye等[47]研究發現外泌體miR-24-3p通過靶向成纖維細胞生長因子11阻礙T細胞功能，并且可以作為鼻咽癌的潛在預后生物標志物。這些研究證明外泌體miRNAs在未來可作為癌癥診治的一種有價值的工具。

Sanada等[48]分析了36例HNSCC患者和7名正常人的血清樣本中外泌體LOXL2蛋白的水平，與健康對照相比，HNSCC患者的平均LOXL2水平高出9倍，統計分析顯示血清外泌體LOXL2水平升高與HNSCC之間存在相關性，表明LOXL2有可能成為HNSCC的潛在的治療靶標。

此外，腫瘤微環境中外泌體能夠誘導周圍腫瘤細胞增強耐藥能力。例如，耐受順鉑的口腔鱗癌細胞OSC-19-R能產生大量攜帶P糖蛋白的外泌體。而P糖蛋白是腫瘤細胞耐藥基因MDR1的表達產物，可與抗癌藥物結合，并將藥物從細胞內泵出細胞外，從而降低腫瘤細胞內的藥物濃度，使腫瘤細胞產生耐藥[49]。

5 結語

隨著經濟和醫療水平不斷發展，人們對疾病的診斷和治療提出了更高的要求。傳統腫瘤組織活檢標本檢測為侵入性操作，具有操作復雜、患者痛苦、價格昂貴等缺點。而液體活檢與傳統檢查方法相比，創傷小、易被患者接受，在腫瘤早期診斷、治療監測、復發預后等方面有著不可替代的優勢。

但液體活檢仍然存在一些局限性。例如，CTCs豐度低，需要進一步提高檢測的靈敏度；ctDNA僅含有腫瘤基因組的信息；外泌體檢測時容易受到其他囊泡的干擾，需要完善分離鑒定技術；液體活檢缺乏統一的分離檢測和分析標準等[50]。液體活檢技術雖然應用前景廣泛，但目前尚不能很好地應用于HNSCC的臨床實踐當中[51]。因此，要將液體活檢與臨床實踐緊密結合，通過大規模臨床研究來驗證其用于臨床常規篩查的實用性，并建立癌癥患者的新型標志物樣本數據庫[52]。隨著檢測技術的成熟和診斷標準的建立，液體活檢有望應用于更多種類疾病的全面檢測。例如，分離出來的血漿可以進行ctDNA或RNA的檢測，分離出來的病原細胞或白細胞可以進行細胞類型的鑒定以及細胞所攜帶的各種生物組學、轉錄組學、蛋白質組學等信息的檢測。通過對多種檢測結果的綜合分析，描繪出一個完整的疾病信息圖譜。隨著技術的成熟和診斷標準的建立和優化，液體活檢在HNSCC診治中將具有更廣泛的應用前景。