藏藥二十五味珊瑚丸治療阿爾茨海默病的網絡藥理學研究

胡賢達

(中國藏學研究中心北京藏醫院科教處，北京 100029)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一種復雜的慢性神經退行性疾病，主要表現為記憶力功能性減退及認知功能下降，并伴有人格和情感障礙等。AD是老年人最常見的癡呆和死亡原因，影響著全世界4 400萬人的健康[1]。同時，隨著全球社會老齡化的加劇，其發病率不斷上升。目前，對AD發病機制的認識尚不清晰，也缺乏行之有效的治療辦法。而隨著藥物臨床試驗的不斷失敗，AD單靶點藥物的開發前景越發黯淡[2]。二十五味珊瑚丸(ByudMar25, BM25)作為具有悠久臨床應用歷史經典藏藥驗方，對于AD展現出良好的治療效果，并被《中華人民共和國藥典》及《中華人民共和國衛生部藥品標準》等法定標準所收錄[3-4]。然而，由于BM25藥物配伍及化學組分十分復雜，其藥理作用機制一直難以探究，阻礙了其在臨床上的廣泛應用。

此前，由南開大學、清華大學、江西中醫學院與北京藏醫院合作完成了BM25的藥代動力學研究，并對于其主要組分及入血成分進行了深入研究[5]。本文在此基礎上，通過反向藥效團匹配法，對BM25主要入血成分的潛在靶點進行預測，并結合生物信息學手段，對以上靶點的所涉主要生物學功能及細胞信號通路進行聚類分析。以系統地探討BM25抗AD可能的藥理作用機制。

1 方法

1.1化合物數據庫的構建通過查閱文獻，收集BM25的主要入血化合物信息。通過NCBI PubChem數據庫檢索，結合ISIS/Draw 2.5軟件，繪制化合物二維結構，并導出為.mol文件[6]。隨后利用Open Babel 2.4.1軟件，將其轉換成三維立體結構，并輸出后綴為.mol2的文件[7]。

1.2靶點預測將BM25入血化合物的立體結構上傳至PharmMapper服務器，采用默認參數對上述配體進行檢測[8]。并利用DGA數據庫，將通過反向分子對接得到的蛋白進行比對，篩選AD相關靶點蛋白，通過UniProt數據庫，將蛋白名轉換為其編碼基因的名稱[9-10]。選擇各化合物匹配分數最高的10個靶點所對應的基因進行生物信息學分析。

1.3生物信息學分析將上述基因集導入GeneAnalytics軟件，注釋各潛在靶標對應基因所涉的生物學功能及分子作用通路[11]。將化合物名稱、靶蛋白對應的基因名稱、主要生物學功能及信號通路導入Cytoscape 3.5.1軟件，繪制BM25的藥理作用網絡[12]。

2 結果

2.1BM25主要入血成分的作用靶點預測文獻顯示，BM25共有35個主要成分或藥物代謝物可從血中檢出，其中包括19個原型藥物及16種藥物代謝物。由于其中3種化合物與另外3種互為異構體的化合物結構相似度較高，預測結果基本一致，因而本文共收集了BM25的32種化合物作為其主要入血成分進行分析，其中包括19個原型藥物及13種藥物代謝物(Fig 1)。通過對上述32個化合物進行反向藥效團匹配，以及AD相關靶點的篩選，并選擇各化合物分數最高的10個蛋白作為主要靶點，得到78個潛在靶點(共320次)，見Fig 2。

2.2BM25的主要生物學功能及分子信號通路分析生物信息學分析結果顯示，BM25對于AD的潛在靶點所對應的基因，主要聚類于炎癥與免疫(158次)、凋亡與自噬(59次)、β淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)表達及清除(56次)共3類生物學功能，以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)(130次)、胰島素(insulin)(124次)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)(92次)、cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB)(46次)、缺口蛋白(Notch)(32次)、神經營養因子(neurotrophin)(30次)、神經酰胺(ceramide)(29次)、無翅相關整合位點(wingless-related integration site, Wnt)(8次)及鈣離子(calcium)(5次)共9條細胞信號傳導通路(Fig 2)。因此推測，BM25可能主要通過作用于MAPK、Insulin及mTOR等分子通路，發揮其抗炎癥、抗凋亡、抗Aβ表達及沉積等藥理作用，進而干預AD的進程。

3 討論

自1906年發現首例AD患者至今已經百余年，雖然人類對AD的發病機制有了不斷深入的了解，然而其發病機制仍不明確，仍缺乏有效的治療方法。目前，FDA共批準5種治療AD的藥物用于臨床，其中4種為乙酰膽堿酯酶抑制劑(actylcholinesterase inhibitor, AChEI)類藥物，另一種為NMDA受體激動劑。然而，沒有任何一種藥物對于AD進程有逆轉或延緩的作用。目前，臨床上主要采用社會心理及家庭看護干預手段，配合AChEI類藥物及神經保護因子緩解AD癥狀。隨著干細胞技術的興起，以及炎癥與免疫學說的出現等，神經干細胞治療與免疫細胞治療也愈發受到重視。然而，目前仍未有具有明確應用前景的、能夠有效治療AD的單靶點藥物出現，而具有多效性特點的傳統藥物在AD治療中的應用，則受到了越來越多的關注[2]。

Fig 1 Structural formulae of main blood components after oral administration of Byur dMar Nyer lNga Ril Bu

Fig 2 Network pharmacology-based prediction on mechanism of Tibetan medicine Byur dMar Nyer lNga Ril Bu against AD

整體觀和辨證論治是包括藏醫學在內的傳統醫學的普遍特征。對于復雜的慢性病的治療，采用傳統醫藥手段往往能夠收獲更好的效果。然而，由于傳統藥物通常成分十分復雜，且每一種化合物往往能夠調控多個靶點，因此通過常規的單一藥物對單一靶點的經典研究方法，很難理清傳統藥物復雜的作用網絡，而作用機制不明也成為其廣泛臨床應用的最大阻礙之一。近年來，隨著系統生物學和生物信息學等學科的快速發展, 網絡藥理學作為一種新的研究模式，被引入天然活性化合物的篩選及多效性藥物的藥理機制研究中。其主要研究目的為探討藥物組分與靶點之間的相互作用網絡，其核心研究內容為收集藥物組分信息，并通過結構生物學與計算化學的方法，研究各組分潛在作用靶點，進而通過生物信息學手段，分析其分子調控網絡及潛在的藥理功能。其系統化的研究方法與傳統醫學的整體論思想殊途同歸，尤其適合闡明復雜藥物及復雜疾病間的相互關系。因此，網絡藥理學正逐漸成為傳統藥物研究中的有力工具，用于分析藥物作用機制、天然活性化合物或活性成分群的篩選，以及新適應癥的發現等工作。

BM25是由18世紀藏醫藥學名家帝瑪爾·丹增彭措研制，并沿用至今的用于包括AD在內的神經系統疾病的經典驗方。由珊瑚、珍珠、珍珠母、青金石、朱砂、龍骨、爐甘石、磁石、腦石、麝香、木香、丁香、沉香、紅花、 訶子、禹糧土、芝麻、葫蘆、獐牙菜、紫菀花、西紅花、藏菖蒲、打箭菊、榜那及甘草組成[3-4]。臨床研究證實，BM25對于各種神經性疼痛、癲癇、腦卒中、多發性周圍神經病等神經系統疾病均具有良好的治療效果[13]。動物實驗顯示，BM25能抑制D-半乳糖誘導的神經元變性和星形膠質細胞的過度激活，HE染色發現，其能夠減輕神經元和星形膠質細胞的損傷，行為學檢測發現其能夠改善模型受損的學習、記憶能力，表明其對于AD也具有潛在的治療作用[14]。

本文基于BM25的入血成分，通過反向藥效團匹配法預測其潛在的作用靶點，并將靶點與疾病進行了關聯。確認BM25具有通過作用于不同靶點，共同發揮抗AD的潛能。此外，通過對靶點功能的聚類分析發現，BM25抗AD的藥理作用機制可能與調控MAPK、Insulin及mTOR等細胞信號傳導通路，干預患者腦組織中炎癥與免疫、凋亡與自噬、Aβ的表達及清除等生物學功能有關。BM25的藥理作用機制在分子水平的實驗研究相對較少，主要包括杜文兵等[13]發現，BM25能夠降低偏頭痛大鼠模型血漿中神經遞質NO和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)的含量；Liu等[15]報道，BM25能夠抑制人神經母細胞瘤細胞SHSY-5Y中磷酸化NF-κB p65的水平。而根據網絡藥理學分析結果，BM25的入血成分具備與NOS及p65的磷酸化直接相關的糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase, GSK)-3β的潛能，可見文中分析結果具備一定的可信度和參考價值。然而，限于網絡藥理學的特點，以及相關研究的缺乏，其真實的藥理作用仍需要通過實驗手段進行證實，但本研究對于相關基礎及臨床實驗的設計及開展能夠起到一定程度的指導作用。

(致謝: 本研究在北京協和醫學院圖書館完成。)