楓楊乙醇提物對膠原誘導性關節炎大鼠的治療作用及其機制研究

朱 健，武璐璐，張全書，王翔鵬，袁 林，向 陽

(1. 湖北民族學院醫學院；2. 風濕病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的自身免疫性慢性炎癥性疾病，其病理特征為炎性細胞與滑膜細胞的增殖和浸潤，導致多關節炎癥、滑膜增厚、骨與軟骨組織受損、關節破壞畸形，甚而多臟器損傷[1]。傳統中醫藥在RA治療方面積累了豐富的經驗，而中草藥的天然特性及其多環節、多靶點的綜合作用方式，使其在RA的治療方面具有獨特的優勢。湖北楓楊(PterocaryahupehensisSkan)可解熱殺蟲、祛風除濕、消腫止痛，常用來治療風濕麻木、寒濕骨痛、關節疼痛、跌打損傷[2]，是恩施民間常用的治療RA的土家藥。本實驗主要觀察了湖北楓楊乙醇提取物對膠原誘導性關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型的影響，初步探討了其可能的作用機制，為湖北楓楊應用于臨床提供一定的理論實驗基礎。

1 材料

1.1實驗動物清潔級♂SD大鼠60只，體質量(200±20)g，購自三峽大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(鄂)2011-0012。適應性喂養1周后開始實驗。

1.2藥品與試劑湖北楓楊由湖北民族學院醫學院中草藥標本中心集中采購，經相關機構鑒定為胡桃科(Juglandaceae)楓楊屬(PterocaryaKunth)植物的干燥莖皮；雷公藤多苷片(浙江得恩德制藥有限公司，國藥準字Z3302042)；無水乙醇、冰醋酸(上海滬試國藥集團股份有限公司)；牛Ⅱ型膠原(美國Chondrex公司)；弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)；TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司)；TNF-α、IL-1β試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司)；p-NF-κB p65、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax抗體(美國Abcam公司)；β-actin抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3儀器旋蒸儀、真空冷凍干燥機(瑞士Buchi公司)；電熱恒溫箱(美國GOLO-SIM公司)；多功能酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；電子顯微鏡(日本Olympus公司)；低速離心機、高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；電泳槽、電轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；超靈敏化學發光成像分析儀(美國GE公司)。

2 方法

2.1湖北楓楊乙醇提取物的制備取湖北楓楊干燥莖皮1 kg，粉碎，用10倍體積75%乙醇浸泡24 h，后用超聲浸提40 min，反復提取5次，每次過濾取濾液，合并5次濾液，離心去渣，減壓濃縮后真空冷凍干燥，得湖北楓楊乙醇提取物200.11 g，使用時用蒸餾水配制成所需濃度。

2.2CIA模型的建立從60只適齡♂SD大鼠中隨機取出10只作為陰性對照組(N組)，其余大鼠用于建立CIA模型。將完全弗氏佐劑與用冰醋酸溶解后4 ℃過夜的牛Ⅱ型膠原，按1 ∶1比例在冰浴條件充分乳化，配制成混合乳劑。在大鼠右后足趾部、尾部、背部多點皮內注射混合乳劑每只0.3 mL，陰性對照組在相同部位注射等體積的生理鹽水[3]。14 d后重復上述步驟。二次免疫3～7 d后，免疫組大鼠足趾腫脹度和關節炎指數明顯增加，膝關節滑膜增厚，同時伴大量炎癥細胞浸潤，即CIA模型構建成功。

2.3分組及給藥將二次免疫7 d后的50只大鼠，隨機分為模型組(M組)、陽性對照雷公藤多苷組(TG組)、湖北楓楊乙醇提取物低(PL)、中(PM)、高(PH)劑量組。當天灌胃給藥，陽性對照組給予6.25 mg·kg-1·d-1的雷公藤多苷(參考60 kg成人臨床常用劑量1 mg·kg-1·d-1，折算成等效大鼠劑量)，治療組分別給予0.42、0.84、1.68 g·kg-1·d-1的湖北楓楊乙醇提取物(低劑量參考60 kg成人臨床常用水煎液劑量0.33 g·kg-1·d-1乘以醇提物約20%的提取率后，折算成等效大鼠劑量，中、高劑量分別為低劑量的2倍、4倍)，陰性對照組、模型組灌胃等量生理鹽水，連續灌胃28 d。

2.4指標檢測

2.4.1大鼠體質量的測定 從第2次免疫d 7(給藥治療d 0)起，測量各組大鼠體質量，每隔7 d觀察記錄1次。觀察各用藥組對CIA大鼠體質量的影響。

2.4.2大鼠足跖腫脹度的測定 用水容積法測量每只大鼠左后足的容積，從第2次免疫d 7起，每隔7 d測量1次各組大鼠左后足容積。觀察各用藥組對CIA大鼠足腫脹度的影響。

2.4.3大鼠關節炎指數的測定 從第2次免疫d 7起，計算大鼠關節炎指數，每隔7 d觀察記錄1次。大鼠關節炎指數計算采取5級評分法：0分，關節無紅腫；1分，趾關節紅腫；2分，趾關節和足趾腫脹；3分，踝關節以下的足爪腫脹；4分，踝關節和所有足爪腫脹、關節嚴重變形。大鼠所有關節炎指數之和即為每只大鼠關節炎指數(arthritis index,AI)值，最高分值為16分。

2.4.4大鼠膝關節滑膜組織病理形態學觀察 給藥28 d后，麻醉大鼠，心尖取血，取大鼠左后足膝關節滑膜，用4%的多聚甲醛溶液固定后脫鈣，乙醇逐級脫水，二甲苯透明，浸蠟包理，切片，進行HE染色；同時左后足膝關節滑膜按照TUNEL凋亡檢測試劑盒進行細胞凋亡檢測。顯微鏡下觀察、拍照，計算滑膜細胞凋亡細胞數。取右膝關節滑膜置-80 ℃冰箱備用。

2.4.5大鼠血清ALT、AST、BUN、SCr及TNF-α、IL-1β含量的測定 將取出的大鼠全血室溫靜置2 h后，3 500 r·min-1離心10 min，取上層血清，分裝。一部分用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中ALT、AST、BUN、SCr的含量；另一部分按照相應ELISA試劑盒，檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量。

2.4.6大鼠膝關節滑膜中p-p65、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白檢測 冰上提取各組大鼠右膝關節滑膜總蛋白，蛋白上樣緩沖液變性后，進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉，洗膜，分別加相應一抗p-p65(1 ∶1 000)、cleaved caspase-3(1 ∶800)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，洗膜后，加入HRP標記的二抗(1 ∶20 000)，室溫下在搖床上孵育2 h。洗膜后，加入ECL發光劑，用凝膠成像系統拍照成像。用Quantity One軟件分析條帶灰度值，以內參β-actin作對照，計算各組目的蛋白的相對表達量。

3 結果

3.1湖北楓楊乙醇提取物對大鼠體質量的影響大鼠第1次免疫后開始出現倦怠、食欲減退，隨之體質量下降。如Fig 1所示，與對照組比較，模型組大鼠的體質量下降(P<0.05)；用藥后，各治療組大鼠體質量較模型組增加(P<0.05)；湖北楓楊乙醇提取物高劑量組大鼠體質量增加較雷公藤多苷組明顯(P<0.05)。

Fig 1 Changes of body weight of rats in each

△P<0.05vsnormal group;**P<0.01vsmodel group;#P<0.05vsTG group

3.2湖北楓楊乙醇提取物對大鼠足跖腫脹度的影響如Fig 2所示，與對照組比較，模型組大鼠足跖腫脹度明顯增加(P<0.05)，出現嚴重的紅腫甚至變形，足掌的寬度、厚度均明顯增加；與模型組比較，治療1周后，各用藥組大鼠足跖腫脹度明顯下降，并持續至用藥4周后(P<0.05)；湖北楓楊乙醇提取物高劑量組足跖腫脹情況在用藥2周后下降，較雷公藤多苷組明顯(P<0.05)。

Fig 2 Changes of paw swelling degreeof rats in each

△P<0.05vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05vsTG group

3.3湖北楓楊乙醇提取物對大鼠關節炎指數的影響如Fig 3所示，大鼠二次免疫后，四肢關節相繼出現腫脹、發紅，隨著時間延長，繼而出現皮膚潰爛、關節畸形等癥狀。與對照組比較，模型組大鼠關節炎指數明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，各治療組大鼠關節炎指數在給藥后持續下降(P<0.05)；湖北楓楊乙醇提取物高劑量組大鼠關節炎指數較雷公藤多苷組下降明顯(P<0.05)。

Fig 3 Changes of arthritis indexof rats in each

△P<0.05vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05vsTG group

3.4湖北楓楊乙醇提取物對大鼠膝關節滑膜HE染色和TUNEL染色的影響大鼠滑膜HE染色顯示(Fig 4)，對照組膝關節滑膜無增生、突起，無炎細胞浸潤；模型組滑膜增生明顯，滑膜襯細胞分層增多、增厚，并伴有大量炎性細胞浸潤；雷公藤多苷組滑膜增生減輕，炎性細胞浸潤明顯減少；湖北楓楊乙醇提取物低劑量組滑膜增生有所改善，炎性細胞浸潤稍減；中劑量組滑膜增生明顯減輕，炎性細胞浸潤減少；高劑量組滑膜輕度增生，炎性細胞浸潤明顯減少。

Fig 4 HE staining of knee synovial membrane of rats in each group(×200)

A:Normal group; B: Model group; C: PL group; D: PM group; E: PH group; F: TG group. The arrows indicate the synovial tissue

經TUNEL染色后，凋亡細胞呈棕色(陽性細胞)，正常細胞呈藍色。大鼠滑膜TUNEL染色計數結果顯示(Fig 5)，模型組滑膜細胞有少量凋亡，凋亡指數與對照組比較差異無顯著性；各組大鼠凋亡指數顯示(Tab 1),與模型組比較，各用藥組陽性細胞數量皆增多，凋亡指數升高(P<0.05)；湖北楓楊乙醇提取物高劑量組滑膜細胞凋亡指數高于雷公藤多苷組(P<0.05)。

Fig 5 TUNEL staining of knee synovial membrane of rats in each group(×200)

A: Normal group; B: Model group; C: PL group; D: PM group; E: PH group; F: TG group

Tab 1 Apoptotic index of each group of

**P<0.01vsmodel;#P<0.05vsTG

3.5湖北楓楊乙醇提取物對大鼠血清TNF-α和IL-1β含量的影響如Tab 2所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量明顯增加(P<0.05)；給藥后，各治療組血清中TNF-α、IL-1β含量較模型組下降(P<0.05)；湖北楓楊乙醇提取物高劑量組血清中TNF-α、IL-1β含量較雷公藤多苷組下降較為明顯(P<0.05)。

3.6湖北楓楊乙醇提取物對大鼠血清ALT、AST、BUN和SCr水平的影響如Tab 3所示，與對照組比較，模型組血清ALT、AST、BUN、SCr水平增加(P<0.05)；湖北楓楊乙醇提取物低、中、高劑量組較模型組下降(P<0.05)；雷公藤多苷組與模型組相比差異無顯著性。

Tab 2 Changes of TNF-α and IL-1β inserum of rats in each

△P<0.05vsnormal;*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05vsTG

3.7湖北楓楊乙醇提取物對大鼠滑膜p-p65、cleavedcaspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響如Fig 6所示，模型組大鼠膝關節滑膜中p-p65、Bcl-2表達較對照組明顯增加(P<0.05)；用藥后，各治療組滑膜內p-p65、Bcl-2表達減少(P<0.01)，cleaved caspase-3、Bax表達增加(P<0.01)；與雷公藤多苷組比較，湖北楓楊高劑量組cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2改變明顯(P<0.05)。

3.8相關性分析如Tab 4所示，TNF-α、IL-1β分別與大鼠體質量呈負相關，與大鼠關節腫脹率、關節炎指數呈正相關。

4 討論

目前，RA的病因病機尚未完全明確。RA的主要病理特點為促炎細胞因子的高水平分泌和病變關節滑膜細胞的增殖，表現為炎癥的反復發作、滑膜增厚、血管翳形成和功能異常，最終引起骨和關節的病變[4]。

炎性反應介質的持續作用在RA的發病和進展中發揮著重要的作用。TNF-α是在RA發病過程中起重要調控作用的細胞因子之一，有研究表明，在RA的活動期和進展期，TNF-α分泌水平增高[5]。TNF-α可增加趨化因子的合成、分泌，影響黏附分子的表達，刺激成纖維細胞和軟骨細胞產生前列腺素和膠原酶，刺激軟骨細胞分泌金屬蛋白酶，加重炎性反應，促進骨和關節的破壞[6]。IL-1β亦是一種重要的促炎細胞因子，可增強單核細胞和淋巴細胞的黏附性和趨化性[7]，使其在炎癥區域游走與聚集；亦可促進前列腺素、金屬蛋白酶的合成和釋放，促進滑膜細胞和淋巴細胞的增殖[8]，在軟骨破壞和骨侵蝕中起著重要作用。另外，IL-1β還可調節多種炎癥因子的表達，協同促進炎癥因子增加[9]。本實驗結果顯示，湖北楓楊乙醇提取物可降低大鼠的足跖腫脹率和關節炎指數，增加大鼠體質量，同時，大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量也下降，且TNF-α、IL-1β含量與足跖腫脹率、關節炎指數呈正相關，與大鼠體質量呈負相關。說明湖北楓楊乙醇提取物可能通過抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達，減輕CIA大鼠的炎癥反應，從而達到保護關節滑膜和軟骨的目的。

Tab 3 Changes of ALT, AST, BUN, and SCr in serum of rats in each

△P<0.05vsnormal;*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05vsTG

Fig 6 Changes of p-p65, cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2proteins in synovial membrane of rats in each

△P<0.05vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05vsTG group

Tab 4 Correlation analysis of various n=10)

*P<0.05vsbody weight;#P<0.05vsjoint swelling rate;△P<0.05vsAI

滑膜細胞的過度增殖活化是RA發病的重要基礎，成纖維滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)凋亡不足是其關鍵因素。正常情況下，FLS增殖與凋亡處于動態平衡中。當RA機體內微環境改變時，如在TNF-α、IL-1β等細胞因子刺激下，FLS出現凋亡缺陷，開始異常增殖，呈腫瘤樣侵襲特性，同時又釋放大量細胞因子、基質金屬蛋白酶，繼而刺激滑膜細胞增殖、炎性細胞浸潤、血管翳形成，侵蝕骨和關節[10]。本實驗結果顯示，給予湖北楓楊乙醇提取物治療后，大鼠滑膜細胞出現不同程度的凋亡，滑膜增生減輕，炎性細胞浸潤減少，同時大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量降低。說明湖北楓楊乙醇提取物可能通過抑制炎癥因子的釋放，促進滑膜細胞凋亡，抑制滑膜增生，從而改善RA的病情。研究表明，只有當核因子NF-κB p65的活性被抑制時，TNF-α才發揮促凋亡作用[11]，而IL-1β亦可通過抑制NF-κB的活性來誘導細胞凋亡[12]。caspase-3作為細胞凋亡過程中的主要效應因子，是細胞凋亡的關鍵執行者，當細胞受到凋亡信號刺激時被激活，導致許多蛋白或激酶失活，引起細胞結構改變、細胞周期阻滯及DNA修復異常，使細胞凋亡[13]。在本實驗中，湖北楓楊乙醇提取物治療組滑膜內p-p65表達降低，cleaved caspase-3表達增加，說明湖北楓楊乙醇提取物可能通過降低p-p65的釋放，激活caspase級聯反應來誘導滑膜細胞凋亡。另外，本實驗還發現，湖北楓楊乙醇提取物治療組滑膜內Bcl-2表達減少，Bax表達增加，Bcl-2/Bax比值降低。Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，當Bcl-2/Bax比值降低時，可使線粒體外膜通透性增加，細胞色素C等膜間隙蛋白釋放[14]，激活下游caspases級聯反應，誘導凋亡。說明湖北楓楊乙醇提取物可能通過調控Bcl-2、Bax蛋白的表達，進而誘導滑膜細胞凋亡。

本研究結果顯示，與對照組比較，模型組血清ALT、AST、BUN、SCr水平增加，說明CIA模型對大鼠的肝臟和腎臟有一定的損傷。湖北楓楊乙醇提取物低、中、高劑量組較模型組下降，說明湖北楓楊乙醇提取物可改善CIA模型對肝、腎的損傷。雷公藤多苷組血清ALT、AST、BUN、SCr水平與模型組差異無顯著性。另有研究報道，雷公藤多苷可對肝、腎有一定程度的損傷[15]。由此可見，在保護肝、腎方面，湖北楓楊乙醇提取物優于雷公藤多苷。

綜上所述，湖北楓楊乙醇提取物對SD大鼠CIA模型有很好的治療效果，并可通過調控相關細胞因子TNF-α、IL-1β及p-p65、凋亡蛋白cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax的表達，起到很好的抗炎和誘導滑膜細胞凋亡的作用。而湖北楓楊乙醇提取物中何種成分影響上述細胞因子和蛋白的傳導，具體通過哪種機制，以及是否還通過其他途徑達到抗炎、促凋亡目的，我們將在后續的實驗中研究和探索。