新型SMO抑制劑SI-4650對人神經膠質瘤U87MG細胞增殖、凋亡和自噬能力的影響

周 游，孫麗丹，楊建林，秦 宇，曹春雨，王艷林

(三峽大學醫學院,腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002)

天然多胺(polyamine, PA)包括腐胺(putrescine, Put)、精脒(spermidine, Spd)和精胺(spermine, Spm)，是一類在真核細胞中普遍存在的、帶高密度正電荷的有機小分子[1]，可通過靜電作用力與細胞中DNA、RNA、蛋白質、磷脂等帶負電荷的生物大分子產生相互作用，參與細胞增殖、分化、發育、細胞應激等重要的生理過程[2-3]。研究發現，細胞內多胺水平升高能促進腫瘤的發生發展，而多胺含量降低則能抑制腫瘤細胞增殖，多胺代謝途徑因此逐漸成為腫瘤防治和抗癌藥物設計的新靶標[4-5]。

多種酶和蛋白因子參與了細胞內多胺代謝的調控，其中精胺氧化酶(spermine oxidase, SMO)在多胺分解代謝中發揮重要作用。該酶直接以Spm為底物，將其氧化為Spd，同時生成3-氨基丙醛和H2O2[6]。研究發現，SMO表達異常導致的多胺代謝紊亂與包括腫瘤在內的多種疾病的發生、發展密切相關[7]，提示特異性靶向SMO的小分子抑制劑在相關疾病的防治中具有重要潛在應用價值。由于目前國內外對SMO小分子抑制劑的研究報道不多，這在很大程度上限制了SMO作為抗腫瘤分子靶點的基礎與臨床應用研究。本研究在前期工作中，運用基于藥效團的計算機輔助藥物設計和高通量虛擬篩選技術，結合分子和細胞水平上的實驗驗證，獲得了一種新型SMO小分子抑制劑SI-4650(SMO inhibitor-4650，其分子結構見Fig 1)，并發現該抑制劑對人非小細胞肺癌A549細胞具有明顯抑制活性。為進一步評價SI-4650的抑瘤譜和對不同腫瘤細胞的殺傷效應，本研究分析了SI-4650對人膠質瘤U87MG細胞多胺代謝、增殖、遷移、凋亡和自噬的影響，為SI-4650在腫瘤防治中的應用提供基礎研究支撐。

Fig 1 Molecular structure of SI-4650

1 材料

1.1細胞株人膠質瘤U87MG細胞購于中國培養物典藏中心(武漢)，由本實驗室傳代保存。

1.2試劑SI-4650(荷蘭Specs生物特殊化合物公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO, 美國Sigma公司)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗(天津灝洋生物)；BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏顯影液(美國Thermo Scientific公司)；RIPA蛋白裂解液(武漢Servicebio公司)；LC3-Ⅰ/Ⅱ抗體、P62抗體、Beclin-1抗體、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase, PARP)抗體，均購自美國CST公司；Bax抗體、Bcl-2抗體(美國Santa Cruz公司)；β-actin抗體(北京科美博瑞)；pEGFP-LC3質粒(美國Add Gene公司)；FITC-Annexin V凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)。

1.3儀器細胞超凈臺(上海新苗)；MCD175型恒溫CO2細胞培養箱、-80 ℃低溫冷凍冰箱(日本SANYO公司)；5424R臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)； Waters e2695高效液相色譜分析儀(美國Waters公司)；FACSVerse流式細胞儀(美國BD公司)； A1+激光共聚焦顯微鏡、TE2000-S熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；全波長酶標儀(美國Thermo公司)；Sirius化學發光檢測儀(德國Berthold公司)；ChemiScope mini化學發光成像顯影儀(上海勤翔)。

2 方法

2.1SI-4650的配制稱取SI-4650干粉溶解于DMSO中，配制成濃度為100 mmol·L-1的藥物儲存液，于-20 ℃低溫保存。使用前，用DMEM完全培養基將藥物儲存液稀釋至所需濃度。

2.2MTT檢測細胞增殖情況將對數生長期的U87MG細胞懸液(5×106·L-1)接種于96孔細胞培養板中，每孔200 μL(1.0×103個/孔)。置37 ℃、5% CO2細胞培養箱中24 h后，換用含不同濃度SI-4650的DMEM培養基繼續培養，每個藥物濃度設置4個復孔。分別繼續培養24、48、72 h后，棄培養基，每孔加入MTT試劑200 μL(終濃度0.2 g·L-1)，于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育4 h后，棄MTT試劑，每孔加入150 μL DMSO充分溶解沉淀，使用酶標儀于490 nm波長處檢測每孔吸光度值(A)。藥物對U87MG細胞生長的抑制率=[1-(實驗組A值-空白組A值)/(陰性對照組A值-空白組A值)]×100%。

2.3化學發光法分析SI-4650對U87MG細胞內SMO、乙酰多胺氧化酶(N1-acetylpolyamineoxidase,APAO)酶活性的影響向用不同濃度SI-4650處理48 h后和對照U87MG細胞中，加入0.083 mol·L-1甘氨酸緩沖液(pH 8.0)200 μL，-80 ℃條件低溫凍融法裂解細胞，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，收集上清，并用BCA法測定其總蛋白含量。各樣本取相同質量的總蛋白液，根據參考文獻配制酶反應體系[8]，以化學發光法檢測上清液中SMO和APAO的酶活性。

2.4HPLC法檢測細胞內多胺含量收集用不同濃度SI-4650處理48 h后和對照U87MG細胞，加入800 μL細胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min后，收集上清液至新的4 mL EP管中。BCA法測定上清中的蛋白濃度后，取總蛋白含量相同的細胞裂解液，用ddH2O補足體積至800 μL。加入1 mmol·L-1DAH 20 μL(內標分子)、2 mol·L-1NaOH 500 μL、苯甲酰氯10 μL，渦旋振蕩30 s，40 ℃水浴20 min后，加入2 mL飽和NaCl溶液終止反應。反應液用2 mL乙醚顛倒混勻萃取，靜置分層后，留取上層乙醚液，重復萃取3次，合并上層萃取乙醚液，通風櫥中揮發至干。用1 mL甲醇溶解沉淀后，經0.22 μm微孔濾膜過濾至樣品瓶中，上Waters-e2695高效液相色譜分析儀進行HPLC分析。HPLC的分析條件：Luna C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)為固定相，乙腈-水(40 ∶60)為流動相，流速1 mL·min-1，檢測波長為254 nm，柱溫30 ℃。

2.5Transwell法分析細胞遷移能力收集用不同濃度SI-4650處理48 h后和對照U87MG細胞，并用含0.2% BSA的DMEM培養基重懸(2.5×108·L-1)。向24孔細胞培養板中加含20% FBS的DMEM培養基(每孔800 μL)，將Transwell小室放入加有上述培養基的培養孔中，并分別向小室內加入細胞懸液200 μL，置37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養48 h后，取出Transwell小室，輕輕吸棄小室內的細胞培養基，用1×PBS潤洗小室3次，后用4%多聚甲醛固定小室30 min。用1×PBS潤洗小室3次，再以結晶紫溶液染色15 min，再次用1×PBS潤洗小室3次后，以濕棉簽拭去小室內側面的細胞，將小室放在滴有1×PBS的載玻片上，于倒置顯微鏡下隨機選取3個觀察視野，計數每個視野中的細胞數。

2.6流式細胞術檢測細胞周期收集用不同濃度SI-4650分別處理24、48 h后及對照U87MG細胞，室溫1 000 r·min-1離心3 min后，棄上清。用1.5 mL預冷75%乙醇(1×PBS配制)重懸細胞，4 ℃固定過夜。室溫1 000 r·min-1離心5 min后，棄上清，加1.5 mL 1×PBS洗滌細胞，室溫1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。用500 μL 1×Binding buffer(PBS配制，含50 μg·L-1RNase和0.1% TritonX-100)重懸細胞后，加0.5 g·L-1碘化丙啶(propidium iodide, PI)20 μL，37 ℃水浴避光條件下染色30 min后，經300目尼龍網將細胞懸液過濾于流式分析試管中，上流式細胞儀檢測細胞周期。

2.7流式細胞術檢測細胞凋亡收集用不同濃度SI-4650處理48 h后和對照U87MG細胞，室溫1 000 r·min-1離心3 min后，棄上清。參照FITC-Annexin V檢測試劑盒說明書，用100 μL 1×Binding buffer重懸細胞，加5 μL FITC-Annexin V和5 μL PI后混勻，25 ℃避光孵育15 min，再以400 μL 1×Binding buffer重懸混勻后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2.8激光共聚焦顯微鏡觀察細胞自噬小體形成將U87MG細胞懸液(5×107·L-1)接種于Confocal專用玻璃底細胞培養皿中，每皿接種3 mL(1.5×105個細胞/皿)。繼續培養至細胞融合度約80%時，根據Thermo TurboFect轉染試劑標準說明書，用2 μg pEGFP-LC3質粒轉染U87MG細胞。轉染培養24 h后，換用含不同濃度SI-4650的DMEM培養基繼續培養48 h，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察外源性重組綠色熒光蛋白GFP-LC3的亞細胞定位，分析U87MG細胞中自噬小體的形成情況。

2.9Westernblot檢測細胞凋亡、自噬相關蛋白表達收集用不同濃度SI-4650處理48 h后和對照U87MG細胞，加100 μL RIPA裂解液冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，將上清液轉移至新的1.5 mL EP管中。BCA法測定上清中的總蛋白濃度，取含60 μg總蛋白的上清液，加1/4體積5×上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min。蛋白樣品經SDS-PAGE電泳分離后，電轉至用5%脫脂牛奶(TBST配制)PVDF膜，室溫封閉2 h后，以TBST洗膜10 min×3次；加對應一抗于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次；再用對應二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，最后用ECL化學發光法顯影并記錄結果。

3 結果

3.1SI-4650抑制U87MG細胞增殖用SI-4650(0、37.5、70、150、300、600 μmol·L-1)分別處理U87MG細胞24、48、72 h后，MTT法分析藥物對細胞增殖能力的影響。Fig 2結果顯示，SI-4650對U87MG細胞增殖具有明顯的抑制作用，抑制效果隨時間的延長和濃度的增加而增強。利用GraphPad Prism7軟件進行統計分析發現，在處理48 h的條件下，SI-4650作用于U87MG細胞的IC50值為(303.475±27.94)μmol·L-1。依據上述結果，后續實驗使用終濃度分別為150、300 μmol·L-1的SI-4650處理的細胞作為實驗組，以0 μmol·L-1處理的細胞作為對照組。

Fig 2 SI-4650 inhibited proliferation of U87MG

U87MG cells were treated with SI-4650( 0,37.5, 70, 150, 300, 600 μmol·L-1) for 24, 48 and 72 h, and then the inhibitory rate of cell proliferation was detected by MTT assay.*P<0.05,**P<0.01vscontrol(0 μmol·L-1).

3.2SI-4650抑制U87MG細胞內SMO和APAO的酶活性用150、300 μmol·L-1SI-4650分別處理U87MG細胞48 h，收集細胞并制備細胞裂解液，每樣本取總蛋白質量為18.65 μg的裂解液，以化學發光法分析SI-4650對U87MG細胞中SMO和APAO酶活性的影響，酶活性以單位總蛋白質量(mg)、單位時間內(s)內的化學發光強度(RLU)表示。如Fig 3所示，與對照組細胞相比，經SI-4650處理后的U87MG細胞中SMO和APAO的酶活性均明顯下降。

3.3SI-4650影響U87MG細胞內多胺的含量用150、300 μmol·L-1SI-4650分別處理U87MG細胞48 h，收集細胞并制備細胞裂解液，以HPLC法分析SI-4650對U87MG細胞內多胺含量的影響。如Fig 4所示，與對照組細胞相比，經SI-4650處理的U87MG細胞中，Put和Spd含量隨藥物濃度增加而明顯下降，Spm含量僅在藥物濃度為150 μmol·L-1時明顯下降，細胞總多胺含量在兩種藥物濃度作用下均明顯降低。

Fig 3 Effect of SI-4650 on enzyme activity ofSMO and APAO in U87MG

*P<0.05,**P<0.01vscontrol(0 μmol·L-1)

Fig 4 Effect of SI-4650 on polyamine

**P<0.01vscontrol(0 μmol·L-1)

3.4SI-4650抑制U87MG細胞的遷移能力分別用150、300 μmol·L-1SI-4650處理 U87MG細胞48 h后，以Transwell法分析SI-4650對U87MG細胞遷移能力的影響。如Fig 5所示，SI-4650可明顯抑制U87MG細胞的遷移能力，且抑制能力隨藥物濃度增加而增強。

3.5SI-4650影響U87MG細胞的細胞周期用150、300 μmol·L-1SI-4650分別處理 U87MG細胞48 h后，收集細胞，流式細胞術分析SI-4650對U87MG細胞周期的影響。如Tab 1所示，與對照組細胞相比，SI-4650處理U87MG細胞后可使G0/G1期細胞數量增多，而G2期細胞數量減少，提示SI-4650可誘導U87MG細胞發生G0/G1周期阻滯。

3.6SI-4650誘導U87MG細胞凋亡用150、300 μmol·L-1SI-4650分別處理U87MG細胞48 h后，收集細胞，并用PI/FITC-Annexin V雙染，流式細胞術分析SI-4650對U87MG細胞凋亡的影響。如Fig 6A所示，高劑量SI-4650可誘導U87MG細胞發生凋亡。進一步的Western blot結果顯示(Fig 6B)，高濃度SI-4650能明顯上調促凋亡蛋白Bax表達，下調凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達水平，Bax/Bcl-2比值升高，且標志性凋亡降解蛋白c-PARP水平明顯增加。值得注意的是，如Fig 6A所示，SI-4650處理后，U87MG細胞壞死的比例也明顯增加。提示除凋亡外，SI-4650還能導致U87MG細胞發生其它方式的死亡。

3.7SI-4650誘導U87MG細胞自噬為分析SI-4650能否誘導U87MG細胞發生自噬，首先用不同濃度的SI-4650處理轉染過pEGFP-LC3真核表達質粒24 h后的U87MG細胞，激光共聚焦顯微鏡下觀察U87MG細胞中外源性表達的GFP-LC3融合蛋白的熒光強度及亞細胞定位。如Fig 7A所示，在未經SI-4650處理的對照組細胞中，GFP熒光蛋白在細胞中呈彌散性均勻分布，而SI-4650處理后，細胞中GFP熒光蛋白呈斑點狀聚集。提示SI-4650能明顯誘導細胞發生自噬，使得GFP-LC3融合蛋白大量向自噬小體發生轉移和聚集。

Tab 1 Effect of SI-4650 on cell cycle of U87MG

**P<0.01vscontrol(0 μmol·L-1)

進一步Western blot法分析SI-4650對U87MG細胞中自噬相關蛋白Beclin-1、P62、LC3-Ⅰ/Ⅱ表達水平的影響。Fig 7B結果顯示，SI-4650處理使自噬活化蛋白Beclin-1和自噬微管蛋白LC3-Ⅱ表達水平隨藥物濃度的增高而大幅增加，而自噬底物蛋白P62的水平則減少。

4 討論

SMO作為一種多胺分解代謝的關鍵酶，其表達水平異常導致的多胺代謝紊亂與包括腫瘤在內的多種疾病的發生、發展關系密切[7]。SMO由此成為抗腫瘤藥物設計和治療的潛在分子靶點。由于目前尚缺乏高效且特異性靶向SMO的小分子抑制劑，使該領域的基礎和臨床研究受到極大限制。SI-4650是本研究前期工作中設計和篩選出的一種SMO小分子抑制劑，為進一步分析SI-4650的抑瘤譜和對不同腫瘤細胞的抗腫瘤活性，本研究在細胞水平上，探索了SI-4650對人膠質瘤U87MG細胞增殖、遷移、凋亡和自噬的影響及其機制。

Fig 5 Effect of SI-4650 on migration ability of U87MG cells(100×) A: U87MG cells treated by 0 μmol·L-1 SI-4650; B: U87MG cells treated by 150 μmol·L-1 SI-4650; C: U87MG cells treated by 300 μmol·L-1 SI-4650; D: Quantized vs control(0 μmol·L-1)

結果發現，SI-4650能有效抑制U87MG細胞增殖(48 h時IC50約為300 μmol·L-1)，并誘導U87MG細胞發生G0/G1周期阻滯。由于SI-4650是以藥效團為基礎設計和篩選的小分子SMO靶向抑制劑，本實驗分析了該抑制劑對U87MG細胞中SMO活性的影響，結果表明，SI-4650能有效抑制U87MG細胞中SMO的酶活性。此外，該抑制劑對細胞內的APAO也具有明顯抑制作用。APAO是參與多胺降解代謝的另一種胺氧化酶，它與SMO之間有較高程度的結構相似性[6]。上述實驗結果提示，SI-4650能通過多靶點途徑干擾細胞內的多胺代謝。

進一步用HPLC法分析了SI-4650對U87MG細胞內多胺含量的影響，結果發現，SI-4650處理后，細胞內總多胺含量下降，Spd(SMO催化反應的產物)含量隨藥物濃度增加而明顯下降，這與預期結果相符合；但Spm(SMO催化反應的底物)含量未見升高，在低濃度SI-4650(150 μmol·L-1)處理時還有明顯下降。產生該現象的可能原因是多胺降解代謝受阻后，Spm經精瞇/精胺N1乙酰基轉移酶(spermidine/spermine N1-acetyltransferase, SSAT)催化轉變為乙酰精胺后，通過U87MG細胞膜表面的多胺轉運載體[9-10]而排出至細胞外。

隨后我們分析了SI-4650對U87MG細胞遷移、凋亡和自噬的影響。結果發現，SI-4650能有效抑制U87MG細胞的遷移能力，并誘導U87MG細胞發生凋亡和自噬。細胞凋亡和細胞自噬分別被稱為I型和II型程序性細胞死亡，二者之間雖然在死亡機制、細胞形態改變、死亡細胞清除方式等方面存在明顯差異，但這兩種死亡方式之間也存在相互影響和相互聯系的復雜關系。目前研究認為，二者之間的關系主要有3種特征：相互促進、相互拮抗和相互協調。在特定的情況下，兩者之間可以相互轉化，形成一種促進細胞死亡的“雙保險”機制[11-13]。本研究發現，相較于對照細胞，高濃度SI-4650(300 μmol·L-1)處理后的U87MG細胞與FITC-Annexin V結合的比率明顯升高，促凋亡蛋白Bax表達上調，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達下調，同時細胞內凋亡降解底物c-PARP水平大幅增高，提示SI-4650可明顯誘導U87MG細胞發生凋亡。

除誘導凋亡外，本研究還發現SI-4650可有效誘導U87MG細胞發生自噬性死亡。用SI-4650處理轉染有GFP-LC3融合基因的U87MG細胞后，細胞內的GFP熒光信號由彌散狀向斑點聚集狀轉化，表明SI-4650處理促使GFP-LC3融合蛋白大量轉移聚集到了自噬小體上。LC3-Ⅱ是自噬體形成的特異性分子標記物，它由LC3-Ⅰ在自噬發生過程中轉化而來，而P62是選擇性的自噬底物，它能結合到LC3-Ⅱ上，在自噬過程中被運輸到自噬小體中降解[14-15]。本研究發現，用SI-4650處理后，U87MG細胞中自噬激活相關蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達增多，但P62蛋白水平降低，這些結果提示SI-4650可明顯誘導U87MG細胞發生自噬性死亡。

Fig 6 Effect of SI-4650 on apoptosis of U87MG cells

Fig 7 Effect of SI-4650 on autophagy of U87MG cells

值得的注意的是，SI-4650本身是甲酰喹啉與一種三胺分子的共價綴合物，尚需進一步探索的是，除抑制SMO活性外，該小分子抑制劑是否還能通過其它不依賴于SMO的途徑，抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞自噬和凋亡。此外，SI-4650中的三胺部分與天然精脒結構類似，它是否能扮演一種多胺類似物的角色，競爭性抑制細胞內天然多胺的代謝與功能，進而發揮多重抗腫瘤效應，這也需要在后續實驗中展開深入分析研究。

綜上所述，本研究證實SMO小分子抑制劑SI-4650可明顯干擾U87MG細胞內的多胺代謝，有效降低多胺含量，可以抑制U87MG細胞的增殖和遷移能力，并誘導U87MG細胞發生凋亡和自噬性死亡。本研究結果提示SI-4650在神經膠質瘤治療中的潛在應用價值。