20-HETE在苯扎貝特保護糖尿病腎病中的作用

丁淑梅，張 杰，邱紅梅，黃 波，吳 芹，蔣青松

(1. 重慶醫科大學藥理學教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016；2. 遵義醫學院基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室，貴州 遵義 563003)

糖尿病是臨床最常見的慢性疾病之一，常伴有嚴重的并發癥。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最主要的并發癥，也是導致終末期腎臟疾病的重要原因。DN病理改變包括腎小球肥大、腎小球基底膜增厚、腎小管間質纖維化、蛋白尿大量增加等[1]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)屬于核受體家族，包括α、β、γ 3種受體亞型，具有調節脂質和葡萄糖代謝、抗炎、抗纖維化等作用，其選擇性激動劑已用于臨床相關疾病的治療[2]。PPARs的3種亞型在腎臟均有表達[3]。臨床研究發現，PPARα受體激動劑非洛貝特可使糖尿病患者的蛋白尿減少，改善糖尿病腎損傷[4]；PPARγ激動劑噻唑烷酮類對DN足細胞損傷有保護作用，從而改善腎功能，減少蛋白尿[5]。而PPARβ的研究相對較少，目前無選擇性PPARβ激動劑上市。苯扎貝特(bezafibrate，BEZ)是目前唯一上市的PPARs泛激動劑，對PPARα、PPARβ和PPARγ都有激活作用[6]。研究發現，BEZ也能減少DN患者的微量白蛋白尿[7]。目前，BEZ主要用于血脂紊亂的治療，而對于其在DN的保護作用及可能機制研究較少。

20-羥-二十烷四烯酸(20-hydroxy eicosatetraenoic acid，20-HETE)是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)ω-羥化酶途徑經細胞色素P450(cytochrome P450，CYP)4A/4F催化生成的代謝產物，對正常生理功能具有廣泛的調節作用，參與多種疾病的病理過程[8]，如糖尿病、心血管疾病、腫瘤等。近年研究發現，PPARs的作用與20-HETE有關。在DN大鼠的腎小球，PPARα受體激動劑氯貝特可上調CYP4A表達，增加20-HETE而產生腎保護作用[9]。在DOCA-鹽誘導的高血壓大鼠模型，另一個PPARα受體激動藥非洛貝特也可以上調CYP4A表達，增加20-HETE而產生降壓作用[10]。那么，在糖尿病引起的腎臟損傷中，BEZ的作用是否也與CYP4A-20-HETE的變化有關？目前國內外未見相關報道。本研究擬利用高糖高脂飲食聯合鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)建立糖尿病模型，以尿素氮(urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿白蛋白、腎臟病理變化為DN形成指標，觀察BEZ對DN的保護作用，以及20-HETE的變化情況。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 6～8周齡清潔級♂昆明小鼠，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(渝)2012-0001。

1.1.2試劑 BEZ購自Sigma公司(純度98%，用0.5%羧甲基纖維素鈉制成混懸液)，批號：BCBK4044V；STZ購自Sigma公司，批號：WXBC2544V；兔抗CYP4A、PPARα、PPARβ、PPARγ多克隆抗體、鼠抗GAPDH單克隆抗體，均購自美國Protein Tech公司；小鼠20-HETE ELISA檢測試劑盒，購自上海江萊生物科技有限公司；ECL化學發光試劑盒購自美國Thermo公司；其余試劑均為國產分析純。

1.1.3儀器 AU5811全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)；ONETOUCH Ultra血糖儀(美國強生公司)；Bio-Rad化學發光成像系統(美國伯樂公司)；DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標儀(美國Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1DN模型的建立 小鼠適應性喂養1 周后，用高糖高脂飲食喂養4 周，腹腔注射STZ(溶于pH 4.5的檸檬酸緩沖液中，現用現配)40 mg·kg-1·d-1，連續5 d。7 d后，用血糖儀測空腹血糖值(fasting blood glucose，FBG)。從40只小鼠中選取FBG≥11.1 mmol·L-1小鼠30只，繼續給予高糖高脂飲食4 周。隨機選擇10只小鼠處死進行病理學檢測，證實DN改變，提示DN模型形成，即為DN模型組。其余糖尿病小鼠隨機分成2組(每組10只)，分別為，DN形成4 周組(DN4W)：給予等劑量的羧甲基纖維素鈉緩沖溶液；BEZ組(BEZ)：BEZ 75 mg·kg-1·d-1灌胃，持續4周。正常對照組(NC)：另取小鼠10只，給予正常飼料喂養4周，連續5 d腹腔注射等劑量的枸櫞酸緩沖溶液，7 d后測血糖值，然后繼續用正常飼料飼養4周后，灌胃給予等劑量的羧甲基纖維素鈉緩沖溶液4周。

每周檢測小鼠的FBG，并用代謝籠收集尿液(檢測尿液體積和尿白蛋白含量)。給藥4周后，眼眶取血，處死小鼠。立即取出腎臟并稱重。計算腎臟指數(腎質量/體質量)。分裝標本，液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2腎功能指標檢測 將血液分裝后，室溫靜置30 min，4 ℃、3 000 r · min-1離心15 min，取血清凍存于-80 ℃冰箱備用。尿液于4 ℃、3 000 r · min-1離心15 min，取上清凍存于-80 ℃冰箱備用。用自動生化分析儀檢測Scr、BUN和尿白蛋白的水平。

1.2.3Masson染色 腎臟組織置于4%的多聚甲醛中固定24 h，75%乙醇脫水，石蠟包埋，制作組織切片。用Masson染色進行病理學檢查。使用Image J 1.43軟件測量腎小球橫斷面面積(glomerular cross-sectional area，GA)，計算平均腎小球體積(glomerular volume，GV)。每只小鼠取20個腎小球的面積，計算GV：GV=β/κ×GA3/2，其中β=1.38，為球體形狀系數；κ=1.1，為粒徑分布系數。每組取5只小鼠。

1.2.4透射電鏡 用冷刀片切取0.5 mm3腎組織置于4%的戊二醛固定液中，4 ℃固定2 h，用PBS清洗3次，后經1%的四氧化鋨固定2 h，常規乙醇和丙酮梯度脫水，環氧樹脂浸透、包埋、聚合、切片，醋酸鈾和拘椽酸鉛雙重染色，置于透射電鏡下觀察。

1.2.5Western blot檢測腎臟組織PPARα、PPARβ、PPARγ、CYP4A蛋白的表達 稱取50 mg腎臟組織，加入0.5 mL RIPA裂解液，4 ℃勻漿。于4 ℃、12 000×g離心15 min，提取腎臟組織蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為40 μg。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，加入一抗GAPDH (1 ∶2 000)、CYP4A (1 ∶1 000)、PPARα (1 ∶1 000)、PPARβ (1 ∶1 000)、PPARγ (1 ∶1 000)，4 ℃過夜；TBST 洗膜，5 min×3次，二抗室溫孵育2 h，洗膜后加ECL發光試劑顯影，采用Image Lab 4.1進行檢測分析，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度/GAPDH條帶灰度，每組重復3次。

1.2.6ELISA檢測20-HETE含量 按照試劑盒說明書操作，用酶標儀于450 nm波長檢測各樣品OD值，根據標準曲線計算血清20-HETE的水平。

2 結果

2.1BEZ對DN小鼠FBG的影響如Fig 1所示，給予STZ 7 d后，DN小鼠 FBG升高至(19.98 ± 2.21) mmol·L-1(P<0.01)。在整個實驗期間，DN小鼠的FBG維持在較高的水平。BEZ給藥FBG水平略有下降(P<0.05)，但仍遠高于11.1 mmol·L-1的糖尿病的診斷標準。

2.2BEZ對DN小鼠腎功能的影響如Tab 1所示，糖尿病形成4周后，模型小鼠BUN、Scr、尿白蛋白明顯升高(P<0.01)，且尿白蛋白比正常組高23.22倍，提示糖尿病小鼠出現了DN。實驗結束時，即DN形成4 周后，模型小鼠BUN、Scr、尿白蛋白升高更加明顯(P<0.01)，尿白蛋白比正常組增加36.21倍，提示模型小鼠DN加重。BEZ治療給藥4周后，使糖尿病小鼠上述指標水平明顯下降(P<0.01)，尿白蛋白降低了71.02%。

Fig 1 Effect of bezafibrate on FBG level in mice

*P<0.05，**P<0.01vsDN4W

Tab 1 Effect of bezafibrate on BUN，SCr and urinary albumin

**P<0.01vsNC;##P<0.01vsDN4W.

2.3BEZ對DN小鼠腎臟病理的影響與正常組比較，糖尿病形成4周后，小鼠腎臟指數(Fig 2C)、腎小球體積(Fig 2D)明顯增大(P<0.01)；Masson染色可見，腎小球中出現膠原纖維、腎小管擴張、空泡變性(Fig 2A)；電鏡檢查可見，小鼠腎臟基底膜不均勻增厚、足突部分融合、系膜基質增加(Fig 2B)。上述病理改變提示DN形成。DN形成4周后，小鼠腎臟指數(Fig 2C)、腎小球體積(Fig 2D)進一步增大(P<0.01)；腎小球中出現大量膠原纖維，相互交聯成網，細胞間質膠原纖維增生，腎小管擴張，空泡變性明顯(Fig 2A)；小鼠腎臟基底膜局部增厚或變薄，微血管瘤形成，足突消失溶解，系膜基質增加(Fig 2B)。BEZ給藥4周后，與DN4W組比較，小鼠的腎臟肥大(P<0.01)、膠原纖維增生、腎小管擴張、空泡變性、基底膜增厚等病理明顯改善。

2.4BEZ對DN小鼠PPARα、PPARβ、PPARγ蛋白表達的影響如Fig 3所示，與正常組比較，DN4W小鼠腎臟PPARα、PPARβ、PPARγ蛋白表達分別減少了31.77%、26.09%、38.71%(P<0.01)；BEZ給藥則使其分別增加了0.27、0.15、0.27倍 (P<0.01)。

Fig 2 Effect of bezafibrate on pathological changes of kidney tissues in mice with diabetic

A: Masson staining (×400); B: Transmission electron microscopic examination (×10 000); C: Kidney index; D: Glomerular volume.**P<0.01vsNC;##P<0.01vsDN4W.

Fig 3 Effect of bezafibrate on PPARα，PPARβ，PPARγ protein expression of kidney in mice with diabetic

**P<0.01vsNC;##P<0.01vsDN4W

2.5BEZ對DN小鼠CYP4A蛋白表達和血清中20-HETE的影響如Fig 4所示，與正常組比較，DN4W小鼠腎臟CYP4A蛋白表達減少了32.00%(P<0.01)，血清20-HETE的含量降低了29.89%(P<0.01)；BEZ給藥則使二者分別增加了0.21倍和0.26倍(P<0.01)。

3 討論

DN是糖尿病最常見和最嚴重的一種并發癥，目前仍然缺乏有效的預防和治療措施。臨床研究表明，BEZ能減少DN患者微量白蛋白尿[7]；聯合小劑量螺內酯治療，BEZ除了降低DN患者血脂水平外，也使尿白蛋白大幅度下降[11]。本研究利用高糖高脂飼料聯合STZ誘導形成糖尿病4周后，糖尿病小鼠的BUN、Scr和尿白蛋白均升高，且尿白蛋白高出正常組10倍以上，達到糖尿病并發癥聯盟網站(AMDCC)所提出的DN動物模型建立標準；同時，模型小鼠出現腎臟肥大、膠原纖維增加、基底膜不均勻增厚、足突部分融合等病理改變。腎臟結構和功能檢測結果均提示，糖尿病小鼠出現明顯腎臟損傷，DN模型建立。BEZ治療給藥4周，明顯改善DN小鼠腎臟結構和功能的受損，延緩DN小鼠的腎臟損傷。另外，給予BEZ治療后，DN小鼠的FBG雖然有所降低，但仍遠大于11.1 mmol·L-1的糖尿病診斷標準，提示BEZ雖然能一定程度降低血糖水平，但對血糖的控制不是其產生腎臟保護作用的根本原因。

Fig 4 Effect of bezafibrate on CYP4A protein expression of kidney (A) and 20-HETE levels in serum (B)

**P<0.01vsNC;##P<0.01vsDN4W

目前，對于BEZ作用的研究仍然主要集中于PPARs受體的激動，尤其是PPARα受體激動后對血脂異常及相關疾病的改善。本研究結果也顯示，BEZ使DN小鼠腎臟組織PPARα、PPARβ和PPARγ蛋白表達均上調?，F有研究發現，PPARs的作用可能與激活20-HETE有關[9-10]。20-HETE是AA CYP氧化酶途徑代謝產物之一。AA代謝網絡產生的生物活性物質具有重要的生理及病理作用，參與調節細胞分化增殖、凝血及纖溶系統動態平衡、體溫及血壓等相關過程。過去研究認為，AA主要經環氧酶途徑和脂氧酶途徑代謝，分別產生前列腺素及白三烯類物質，發揮其對炎癥及代謝等的調控作用。近十余年研究發現，AA的“第三條代謝途徑”——CYP氧化酶途徑產物環氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)和20-HETE在正常生理狀態的維持和病理過程的進展中也具有重要作用[8]。

20-HETE在腎臟高度表達[12]。在糖尿病的離體和整體模型，其腎臟的微粒體、近端腎小管上皮中CYP4A表達和20-HETE生成增加，抑制20-HETE的生成對DN有保護作用[13-14]。但也有相反的研究結果。在DN大鼠的腎臟及腎小球，CYP4A表達和20-HETE產生減少；給予內源性和外源性的20-HETE對腎小球通透性屏障有保護作用，減輕蛋白尿，延緩腎纖維化的進程[9,15]。本實驗結果與后者一致，在高脂飲食聯合STZ誘導DN模型，腎臟組織CYP4A表達下調，20-HETE產生減少。給予BEZ治療4周后，糖尿病腎損傷改善同時，CYP4A上調，20-HETE增加。本實驗結果提示，CYP4A-20-HETE的活化可能參與了BEZ對糖尿病腎損傷的保護作用。

綜上所述，在本實驗條件下，BEZ對DN小鼠的腎損傷有保護作用，該作用的發生可能與BEZ上調CYP4A表達，增加20-HETE含量有關。由于DN參與因素的復雜性和BEZ作用的廣泛性，BEZ對DN保護作用的參與機制仍需要進行更深入研究。

(致謝：本文實驗在重慶醫科大學藥學院生物化學與分子藥理學重點實驗室完成，特此致謝！)