Keap1-Nrf2信號通路在肝再生中的作用及相關藥物研究進展

白慶云

(宜春學院化學與生物工程學院，江西省天然藥物活性成分研究重點實驗室，江西 宜春 336000)

肝再生是肝臟在化學損傷或者手術切除部分肝臟后，殘留肝細胞通過細胞增殖由原來的基本不生長狀態轉變為快速生長狀態，以恢復在功能和解剖學上損失的組織[1]。目前，人類面對的最主要致命疾病之一就是肝硬化和重型肝炎等肝病，在我國肝臟疾病發病率越來越高，肝臟疾病或損傷遷延不愈最終會發展成為肝硬化，甚至肝癌。從全球來看，在終末期肝病發病率方面，我國是最高的國家，每年新增患者在600萬例以上[2]。嚴重的肝損傷往往需要進行肝臟移植，而這往往會加重患者的經濟負擔。如果能通過藥物等手段使肝損傷后的肝臟得以修復，或者能促進肝部分切除術和肝臟移植后的肝臟再生，都是非常有意義的。因此，深入了解肝再生過程中的特點、規律和機制，并在此基礎上進行適當干預，是目前一個非常重要的課題。本文就肝再生的影響因素、過程和機制、核因子E2相關因子2 (NF-E2-related factor 2, Nrf2)在肝再生中的作用以及影響肝再生的藥物進行綜述。

1 肝再生

肝臟本身具有非常強的再生功能，肝部分切除后，剩余肝臟的肝細胞在分裂與增殖方面都特別活躍，短期內便可使肝臟恢復到原來的尺寸。以進行了肝切除的大鼠為例，切除其肝的90%之后，僅兩個星期的時間，肝臟的重量就可以恢復到原來的水平，但是在這以后結構的恢復需要很長的時間，只有待新的肝小葉結構成形，原有功能才會恢復[3]。除了肝切除術后會出現肝再生，藥源性肝損傷后也會出現肝臟再生，如大量長期使用對乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)后，肝臟會在成纖維細胞生長因子19的促進下再生[4]。

肝再生分為3個主要過程[5]：(1)啟動階段：肝再生啟動階段是指原來處于靜止狀態的肝細胞重新進入細胞周期。在此階段中，涉及到的細胞因子主要包括腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α，TNF-α)和白細胞介素6 (interleukin 6，IL-6)。機體切除肝臟之后，在1 h之內機體的TNF-α含量明顯升高，因為TNF-α在肝再生的早期階段和對應的受體結合之后，會產生一種特殊的細胞內信號，激活轉錄因子的啟動。IL-6在急性反應后，與受體一起激活酪氨酸激酶，隨后信號傳導蛋白和轉錄激活物(signal transducers and activators of transcription 3, STAT3)被激活，表達增加，同時激活其他轉錄因子的表達，然后在生長因子的促進下，肝再生過程被啟動。(2)增殖階段：肝再生增殖階段主要指肝細胞在促有絲分裂原的作用下，進行細胞分裂和增殖的過程。此階段是整個肝臟再生的重要階段，涉及到的最重要的細胞因子主要為表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)和肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)。(3)終止階段：當細胞增殖完成后, 肝臟在組織學上的結構得以恢復，肝再生便進入終止階段。參與此階段的主要是卵圓細胞，它在肝臟細胞增殖過程中數目發生明顯變化，推測它可能促進肝細胞的再生，促進了肝臟的修復。

2 Keap1-Nrf2-ARE信號通路

Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Keap1)是細胞氧化應激反應中的調控因子，為含有624個氨基酸的多肽，是Nrf2在細胞質中的結合蛋白。Nrf2是含有6個高度保守的結構域Neh的氧化應激轉錄因子，是抗氧化反應元件(antioxident response element, ARE)在靶基因的啟動子[6]。通常情況下，Nrf2存在于細胞質中并與Keapl結合，起到將Nrf2固定在胞質中的作用，同時Keapl與泛素化連接酶結合，對Nrf2的泛素化與降解產生促進作用。在接觸了一些外界刺激后，如經過活性氧(reactive oxygen species, ROS)、活性氮、脂質醛和15-脫氧-D-內源性前列腺素的刺激，Keap1和Nrf2會分離開來。一旦Nrf2進入細胞核，在Maf蛋白的作用下，Nrf2同ARE結合，啟動下游基因的轉錄與表達，如抗氧化蛋白、Ⅱ相解毒酶、蛋白酶體Π分子伴侶等，從而發揮抵御內外界的有害刺激的作用[7]，見Fig 1。

Fig 1 Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway

在生理狀態下，Nrf2參與調節氧化還原平衡、細胞的增殖、凋亡過程、炎癥過程、物質代謝、蛋白質的折疊等。眾所周知，Nrf2是機體氧化還原反應的主要調節器，它可以對多種抗氧化基因的表達產生促進作用，如谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)、醌氧化還原酶1[NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1, NQO1]、血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(glutamate cysteine ligase catalytic, GCLC)、谷氨酸半胱氨酸連接酶(glutamate cysteine ligase modifier subunit, GCLM)等[8]。Nrf2能降低藥物對不同器官的毒性，如藥物對腦、肺、皮膚、肝臟、腎臟的毒性，同時對某些疾病具有改善作用，Mao等[9]在實驗中發現，小鼠由于缺乏Nrf2導致神經缺損和神經細胞凋亡、創傷性腦損傷、運動功能障礙和脊髓損傷。此外，Keap-Nrf2-ARE信號通路還與衰老、細胞損傷、生育等多方面關系密切。

3 Keap1-Nrf2-ARE信號通路與肝再生

Nrf2-ARE信號通路通過多個環節對抗肝臟的氧化損傷，如調節肝臟的代謝、解毒和促進肝細胞增殖。大量研究發現，Nrf2通過調節肝細胞增殖而促進肝的再生。Zou等[10]通過實驗結果得出Nrf2在肝再生中類似于一個細胞周期調節器，這個觀點在肝臟部分切除手術中的小鼠上得以證實，他們發現Nrf2的缺乏不影響進入細胞周期的肝細胞數目，只是使細胞有絲分裂受到抑制。作者還證明在肝再生中，Nrf2通過細胞周期素A2(Cyclin A2)和Wee1/Cdc2/Cyclin Bl途徑，來調節肝細胞的增殖。另一方面，胡敏[11]也進行了有關Keap1-Nrf2在肝再生中調控氧化還原循環和對肝細胞周期影響的研究，該研究將Keap1+/+和Keap1+/-小鼠，以及Nrf2+/+與Nrf2-/-小鼠切除其2/3肝臟，術后在不同時間點對細胞周期蛋白、肝細胞增殖、肝氧化還原狀態以及有絲分裂信號分子的功能進行了評價。結果顯示，Keap1基因敲除能夠延遲增殖的肝細胞進入S期，擾亂有絲分裂的節律性，但對肝細胞整體的再生過程影響不大，而Nrf2基因敲除延緩了小鼠的肝再生過程。

APAP是引起藥物性肝損傷的主要原因之一。研究人員通過給小鼠注射APAP 400 mg·kg-1后發現，在12 h內小鼠出現嚴重的肝毒性，而肝臟功能的恢復卻要在24 h之后。注射APAP后，Nrf2的表達量和在細胞核中的積累量都有增加，24 h后，Nrf2下游基因NQO1、GCLM和HO-1的表達也增加。此外，給予APAP注射后，p53及其下游基因p21表達快速增加，48 h后，細胞周期依賴性激酶4 (cyclin dependent kinase 4, CDK4)、細胞周期素D1(Cyclin D1)、肝再生增強因子、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的水平均明顯提高，提示啟動組織修復與肝細胞增殖。此研究說明，在APAP發生損傷之后，Keap1-Nrf2-ARE通路調控肝再生是一個動態的調節過程[12]。同樣，Dayoub等[13]也證實了Nrf2通過誘導肝再生增強因子(augmenter of liver regeneration, ALR)，促進肝臟再生。但也有研究報道稱，Nrf2延遲了肝細胞的增殖，并誘導肝細胞在肝再生中的凋亡[14]。

此外，還有一些關于Nrf2在肝再生、肝臟疾病和各種外界因素引起的肝損傷中作用的報道。Shin等[15]分析了Nrf2在病毒性、藥物性和化學性肝炎或者是一些肝臟疾病，如酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、肝纖維化、肝硬化、肝癌中的作用，發現Nrf2的缺失會使小鼠對各種應激的抵抗性降低，而Nrf2的誘導劑可以用于致癌物質的預防，說明Nrf2在肝臟病理生理學中具有舉足輕重的作用。Wakabayashi等[16]通過對Keap1-或Nrf2-阻斷后小鼠的分析，發現Keap1-Nrf2-ARE信號通路和Notch1信號通路有關，而Notch1是一種細胞增殖調節劑，在調節肝再生方面發揮重要作用。Buitrago-Molina等[17]報道稱，在p21缺陷的小鼠中，肝臟的再生和肝癌的發生被削弱，而且肝臟的損傷程度和p21的活性強度決定Nrf2對肝再生的影響。Beyer等[18]分析了Nrf2在細胞氧化還原穩態中的調節作用，在Nrf2缺失的情況下，進行了部分切除手術的肝臟的肝再生被延遲，這表明Nrf2可以激活急性或慢性疾病后肝臟的再生和修復。肝再生過程的分子機制以及Keap1-Nrf2-ARE信號通路對肝再生的調節機制見Fig 2。

Fig 2 Regulation of Keap1-Nrf2-ARE signaling

4 促進肝再生藥物的研究

肝臟再生是一個很復雜的細胞增殖的過程，在實際的肝臟再生過程中，多種細胞因子和信號通路參與到肝臟再生的調控中。Keap1-Nrf2-ARE信號通路在肝再生中具有重要的調控作用，參與肝再生的各個環節，因此，研究作用于此信號通路的藥物，對肝臟損傷或者手術切除后的肝修復和再生具有重要價值。

除上述天然藥物活性成分外，還有少數合成藥物也可以通過抗氧化促進肝再生，如雙環醇為人工合成的抗病毒性肝炎的新藥。姚曉敏[23]研究發現，雙環醇可抑制肝臟部分切除大鼠肝臟和微粒體中MDA的含量，還能恢復肝臟SOD活性，阻止肝臟谷胱甘肽(glutathione, GSH)耗竭，通過抗氧化損傷來減輕ROS對肝細胞增殖的抑制作用，從而促進肝細胞增殖。Shimada等[24]研究發現，硫氫化鈉可通過直接和間接的抗氧化活性，改善肝臟缺血/再灌注損傷，經硫氫化鈉處理后，PCNA陽性細胞的比率明顯增高。該研究顯示，硫氫化鈉能增加Nrf2的核移位，上調HO-1的表達，并通過PDK-1/Akt/mTOR/P70S6K信號通路，抑制細胞凋亡，促進肝細胞的再生。

5 結論及展望

肝臟是機體的一個重要的代謝器官，具有潛在再生能力，當受到病理性的損傷或部分切除后，便會啟動再生程序。肝臟損傷或被部分切除后，Keap1-Nrf2-ARE信號通路通過影響肝細胞的細胞周期和有絲分裂等方式，促進肝臟的再生。肝再生的狀況決定性地影響肝臟組織解剖學上的重建和肝功能的修復，所以對于肝臟被部分切除、肝移植的患者或者嚴重的肝損傷來說，通過藥物干預以促進肝臟的修復和再生就顯得尤為重要。由于Keap1-Nrf2-ARE信號通路對肝再生的關鍵性，那么能夠激活此信號通路的藥物，就有可能成為促進肝再生的潛在新藥，這可以為促肝再生藥物機制的研究和以后的新藥研發提供思路。通過上述文獻綜述可以看出，這方面的藥物研究多集中于天然產物，但為數不多，說明相關的藥物研究有待加強。