外泌體在帕金森病中的研究進展

孔凡叢， 呂占云綜述， 楊 燕審校

帕金森病(Parkinson disease，PD)是發病率僅次于阿爾茨海默病的第二大的神經退行性疾病，其病因和發病機制目前尚不明確，臨床主要表現為靜止性震顫、肌強直、行動遲緩和姿勢平衡障礙等運動癥狀。而外泌體廣泛存在于腦脊液和外周體液中，擁有細胞間信號傳導和病原體的轉移以及細胞碎片的清除等生理功能，且在PD發展過程中其內容物發生改變。正是由于外泌體獨特的生理功能以及在PD的發病、發展及治療中所起到的作用而廣受關注[1]。本文就外泌體在PD中的相關研究進展綜述如下。

1 外泌體

細胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)包含從細胞釋放的各種膜限制性囊泡(membrane-limited vesicles)。根據這些囊泡的來源或大小，大致分為三類：凋亡小體，微泡(MV)和外泌體[1，2]。其中外泌體是來自內體系統(endosomal system)的最小和最具特征化的囊泡。外泌體是多泡體(multivesicular bodies，MVBs)與質膜融合后形成的直徑為30～100 nm、密度范圍為1.13～1.19 g/ml之間并釋放到細胞外的膜性微囊泡，在電鏡下呈雙凹碟形或杯狀[2，3]。外泌體可以將多種特異性蛋白質、脂質、mRNA、微小RNA和雙鏈DNA等特殊物質在不同類型的細胞內傳遞到鄰近或遠距離的靶細胞，然后釋放所運載的物質，最后識別并作用于相應的靶細胞。另外，外泌體調控許多重要的細胞生理活動，在免疫應答、凋亡、血管生成、炎癥反應等過程中的作用均有相關報道，它既能成為多種疾病的早期診斷標記物，也能作為靶向藥物的載體進行疾病治療[2]。同樣，在PD中外泌體可以介導神經元和神經膠質的交流，既可以促進神經元的修復和生長，也能促進PD等神經退行性疾病的發展[4，5]。

2 外泌體在PD中的作用

2.1 α-突觸核蛋白與外泌體在PD中的作用 雖然PD的病理特征需進一步研究，但目前研究表明PD患者腦中特異性蛋白質即具有多巴胺能神經毒性的α-突觸核蛋白的聚集是其病理特征之一。α-突觸核蛋白是路易體的組成成分之一，它是被外泌體包裹的突觸前神經元蛋白[5]。α-突觸核蛋白從結構上看是由140個氨基酸和3個區域組成，3個區域從功能上看，N-末端形成的α-螺旋在磷脂囊泡的結合中起作用，C-末端區域具有伴侶分子樣功能，“非Aβ組”在聚集過程中起重要的作用[6]。由于α-突觸核蛋白是路易體中異常蛋白質沉積的主要成分，在PD發生發展過程中起著主要而肯定的作用[5]，且研究表明α-突觸核蛋白參與外泌體的運輸活動，因此越來越多的研究關注α-突觸核蛋白與外泌體在PD中的作用。

起初，相關研究表明α-突觸核蛋白僅在細胞內發揮其致病作用，但這一觀念被El-Agnaf等[7]打破，因為他們在人類血漿和腦脊液中發現包含α-突觸核蛋白的外泌體可以在腦內擴散。Emmanouilidou等[8]通過SH-SY5Y細胞證明α-突觸核蛋白通過外泌體輸出，去影響鄰近神經元的生存能力以促PD發展。相關研究發現這一過程可以進一步誘導外泌體的形成、加速α-突觸核蛋白在腦內的蓄積[9]，這與最近從PD患者的腦脊液中分離出外泌體的研究結果相符。此外，Stuendl等[10]發現外泌體α-突觸核蛋白水平與認知障礙的嚴重程度有關，這從某種程度上證實臨床上部分PD患者發病后的幾年內出現認知功能的下降。α-突觸核蛋白通過外泌體輸出，這一觀點被Alvarez-Erviti等[11]進一步證明。他們發現SHSY5Y細胞過表達的外泌體中含有α-突觸核蛋白，這些外泌體可以有效將α-突觸核蛋白轉移至正常的SHSY5Y細胞，而且這些含有α-突觸核蛋白的外泌體抑制PD腦中溶酶體功能。從而導致外泌體中α-突觸核蛋白釋放增加，而這些蛋白向受體細胞擴散范圍增加。Danzer等[12]試圖尋找外泌體相關的α-突觸核蛋白的特點。有研究發現在PD患者腦脊液中的外泌體以劑量依賴性方式誘導α-突觸核蛋白的寡聚化，在鑒定外泌體的α-突觸核蛋白寡聚體的過程中發現這些外泌體中α-突觸核蛋白寡聚體對鄰近細胞的毒性比不含外泌體的α-突觸核蛋白寡聚體更大。此外，還有其他相關研究支持外泌體在PD中的神經毒性作用。Chang等[13]發現α-突觸核蛋白可以決定小膠質細胞的外泌體分泌量，此外，活化的外泌體可以增加細胞凋亡，這支持了外泌體可能介導神經變性的假說。

上述研究都進一步證明聚集的α-突觸核蛋白可以在神經元之間傳播的理論，該理論可以闡述PD逐漸發展的機制。由此表明α-突觸核蛋白表達的降低可以延遲或阻止PD進展，并且通過外泌體降低α-突觸核蛋白表達來延緩或阻止PD的發展可以給PD帶來新的診治思路[11]。

2.2 Micro RNAs(miRNAs)與外泌體在PD中的作用 Micro RNAs(miRNAs)是一類在進化上高度保守的非編碼RNA，在基因的轉錄翻譯、細胞生長、組織分化和細胞凋亡、遺傳和表觀遺傳等生命活動中發揮重要調控作用，與腫瘤的發生、神經系統疾病、心血管疾病等有著千絲萬縷的關系。單個miRNA可以調控數百個目標基因的表達，因此一組miRNAs的改變可能會極大地影響PD的病理生理學和結局[14]。

有相關研究發現miR-205的上調能抑制PD患者腦組織中LRRK2蛋白的異常上調[15]。miR-34b/c在PD患者腦組織表達下調，并且進一步研究發現miR-34b/c的早期下調會觸發下游轉錄組改變，這些改變導致線粒體功能障礙和氧化應激，最終影響細胞活性[16]。同樣地，小膠質細胞中miR-7116-5p的下調促進了TNF-α的產生，然后TNF-α進一步刺激其他促炎因子的產生從而導致多巴胺能神經元損傷[17]。另外，miR-135a-5p的下調與ROCK2上調啟動多巴胺能神經元的吞噬功能[18]。對此，相關研究證實miR-135a-5p 激動劑可能保護多巴胺能神經元免受吞噬作用[18]。Kim等[19]發現 miR-133b在中腦多巴胺能神經元特異性表達，并可調控中腦多巴胺能神經元的成熟和功能，但PD患者的中腦組織缺乏該miRNA。Doxakis等[20]發現 miR-7和miR-153能與α-突觸核蛋白mRNA的3’非編碼區特異結合，下調該mRNA和α-突觸核蛋白的水平。Li等[21]發現外泌體MiR-221通過靶向作用PTEN來調節PC12細胞活力和凋亡，從而在PD中起保護作用。然而，上述與PD有關的特異性miRNA功能的實現需要借助外泌體的轉運功能。通過外泌體將這些miRNAs包裹，使其免受防御系統的識別、攻擊而產生的一系列免疫反應，使其保證結構和功能的完整性，從而干預PD發生、發展[14，22]。

包含miRNAs的外泌體作為PD的診斷性生物標志物，可以在疾病的最早階段進行檢測并進行治療，以延遲發病或延長疾病發展到晚期階段的時間[14]。然而，也有研究表明其他器官的細胞也會分泌包含miRNA的外泌體并釋放到血液中，因此循環水平的miRNA可能無法準確反映病變大腦本身特定miRNA的水平[23]，這也是外泌體相關研究的難點和重點。

2.3 基因與外泌體在PD中的作用 許多與PD相關的基因(包括LRRK2、VPS35和PARK9)在自噬和內吞途徑中發揮重要的作用，并且有研究表明PD相關基因與外泌體發生和釋放相關。例如：LRRK2蛋白參與蛋白質的分選、運輸、自噬，以及外泌體的結合、釋放[24，25]，VPS35參與外泌體的內體運輸[26]，在外泌體中發現PARK9蛋白是P型轉運ATP酶[27]，調節外泌體合成。此外，PARK9過表達減少了SH-SY5Ys細胞內的α-syn水平，并增加了外泌體中的α-syn外顯化[28]。相反，PD患者的成纖維細胞失去PARK9調控后，多囊泡體中的腔內囊泡數目減少，并且外泌體釋放到靶細胞的數量減少[29]。盡管有不少基因調控外泌體的發生、發展及功能應用，但具體的調控機制仍需要進一步研究，以便將研究應用到臨床中。

3 外泌體的應用前景

外泌體擁有廣闊的應用前景，原因在于其不僅擁有穩定性、低免疫原性等特點，而且運輸功能更為強大；可以運載具有治療作用的siRNA(silencingRNA)、miRNA甚至是藥物，還可以運載具有神經毒性的α-突觸核蛋白。除此之外，最重要的一點是它可以穿過血腦屏障，將運載物送達靶細胞[30]。

Shi等[31]研究發現即使腦脊液中外泌體α-突觸核蛋白被認為是PD的生物標志物，與對照相比，PD患者腦脊液中外泌體α-突觸核蛋白的含量較低，PD患者的血漿中外泌體α-突觸核蛋白的含量更高。該研究還發現這些血漿中α-突觸核蛋白在PD與對照者中的含量在靈敏度和特異性方面與CSFα-突觸核蛋白接近，血漿外泌體α-突觸核蛋白與疾病嚴重程度之間有顯著相關性。目前與α-突觸核蛋白有關的研究也支持含有α-突觸核蛋白的外泌體對PD的診斷治療具有一定的作用[32]。因此，阻止包含α-突觸核蛋白的外泌體釋放和攝取是有關PD的一種新型診療思路。

近期研究報道，與正常對照者相比，從PD患者的血細胞、血漿、血清和腦脊液外泌體中也可檢測到差異表達的miRNA，并且一些差異表達的miRNA 有助于PD的診斷。并且，結合的miRNA具有來源豐富、組織特異和高度穩定的特點，因此miRNA被認為是適合作為PD 的生物標志物[33]。

外泌體不僅可以用于診斷還能用于治療。有相關研究發現血液外泌體可以穿過血腦屏障成功地將多巴胺送至紋狀體、黑質，且在腦內分布濃度可高達15倍。并且該研究還發現包裹多巴胺的外泌體的靶向治療不僅效果優于靜脈內注射游離的多巴胺，而且對神經毒害作用更低[34]。

盡管外泌體有著廣泛用途，但外泌體也具有傳播如朊病毒樣蛋白質[35]和病理性炎癥[36]等不利方面，所以外泌體在PD中的應用依然還要走很長的一段路。

4 小結與展望

雖然外泌體有很廣闊的應用前景，但是我們還有許多的問題亟待解決，例如：神經元細胞如何識別不同的外泌體，外泌體包裹的物質如何被識別、卸載、利用，外泌體是如何穿過血腦屏障、如何逃避免疫反應以及外泌體如何選擇需要運載的物質、同一細胞又會分泌多少種不同的外泌體。此外，用外泌體診斷治療PD對我們來說是一種新型的診療思路，這其中還有許多問題有待進一步探討。