安神臍貼對實驗性失眠模型大鼠自主活動及血清GABA、NE含量的影響*

甘 雨 馬 進 喬 敏 張 宏 包玉龍 武曉琳 劉小虎 焦富英

(遼寧省中醫藥研究院， 沈陽 110034)

隨著生活節奏的加快，人們所面臨的各種壓力驟增，失眠癥已逐漸成為嚴重危害公眾健康的問題。失眠患者由于睡眠時間不足、質量不佳，致使機體得不到充分休息，而影響日常生活，表現為精神不振、注意力不集中、行動反應遲緩、學習記憶功能下降，警覺性水平和判斷力降低[1]。以往臨床多采用鎮靜催眠類藥物和心理療法治療，前者短期療效尚可，但需長期服藥，而長期用藥會出現耐藥性、共濟失調、依賴性等副反應[2]；后者效果不穩定，影響因素頗多。因此，探尋一種更有效、安全的治療方法迫在眉睫。安神臍貼為我院神經內科經驗處方，由朱砂、黃連、酸棗仁等中藥組成，療效確切，且為外用制劑，安全無副作用。本研究考察了其對實驗性失眠模型大鼠自主活動的影響，并初步探討了其神經調節機制，以期為臨床應用提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠，SPF級，雄性，體質量180～220 g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。飼養于遼寧中醫藥大學附屬第二醫院實驗動物中心，許可證號：SYXK(遼)2012-0003，溫度20～23 ℃，相對濕度50%～60%，12 h光照/12 h黑暗環境。

1.2 藥物與試劑

安神臍貼由遼寧中醫藥大學附屬第二醫院制劑中心提供；地西泮片由上海上藥信誼藥廠有限公司生產，批號：14160101。水合氯醛由國藥集團化學試劑有限公司生產，批號：20150508；對氯苯丙氨酸(4-Chloro-DL-phenylalanine, PCPA)由SIGMA公司生產，批號：SHBD9164 V；生理鹽水，華仁藥業股份有限公司生產，批號：Q1611028。大鼠γ-氨基丁酸(GABA)檢測試劑盒，購自沈陽天瑞誠生物科技有限公司，批號：201703；去甲腎上腺素(NE)檢測試劑盒，購自沈陽天瑞誠生物科技有限公司，批號：201703。

1.3 儀器設備

EthoVision大小鼠行為學系統，荷蘭NOLUDS公司；SPECTRA MAX 190型酶標儀，美國Molecular Devices公司；JKDP-2型電熱恒溫培養箱，廈門醫療電子儀器廠。

1.4 方法

1.4.1分組與模型制備: 取40只健康SD大鼠，置于12 h光照/12 h黑暗環境中適應性飼養7 d后，按體質量隨機分為4 組，分別為空白對照組、模型對照組、安神臍貼(2.70 g/kg)組和地西泮(0.90×10-3g/kg)組，每組10只。除空白對照組外其余各組大鼠均腹腔注射PCPA混懸液(350 mg/kg)，空白對照組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，每日上午9：00注射1次，連續注射2 d。造模大鼠晝伏夜出規律消失，白天睡眠時間明顯少于空白對照組，表明模型制備成功。

1.4.2給藥: 給予貼劑大鼠于給藥前24 h腹部脫毛(6%硫化鈉)，充分暴露神闕穴。安神臍貼組在腹部神闕穴部位貼敷安神臍貼2.70 g/kg，空白對照組和模型對照組在腹部神闕穴部位貼敷空白貼，均用膠布固定6 h以上，1次/d，連續5 d。地西泮組灌胃給予地西泮0.90×10-3g/kg，1次/d，連續5 d。

1.4.3一般狀況觀察： 每日觀察大鼠一般狀況及活動情況，并于末次給藥前稱量大鼠體質量，比較大鼠體質量增長情況。

1.4.4自主活動檢測： 于末次給藥60 min后，采用EthoVision大小鼠行為學系統記錄大鼠自主活動情況，該系統由自主活動測試箱和圖像采集分析系統兩部分構成。自主活動測試箱底為1.0 m×1.0 m 正方形不銹鋼箱，箱底內中央0.5 m×0.5 m正方形區域劃分中央區，其余為周邊區，記錄10 min內大鼠移動距離、速度、出現在中央區的頻率及在中央區累計停留時間。

1.4.5血清GABA、NE含量檢測： 自主活動試驗后，將大鼠用水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，腹主動脈取血，3000 r/min離心10 min，取血清。按各試劑盒操作步驟處理后，用酶標儀在450 nm波長下依序測量各孔的吸光度(A)，采用外標法繪制標準曲線，計算血清GABA、NE含量。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 一般狀況

造模結束后，模型組大鼠晝伏夜出規律消失，皮毛蓬亂無澤，易激怒，攻擊性增強，白天也不停走動，體質量增長緩慢，與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。給藥后逐漸好轉，白天活動減少，睡眠時間延長，體質量明顯高于模型對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質量變化情況Table 1 The body weight changes of rats in

注：與空白對照組比較,*P<0.05；與模型對照組比較,▲P<0.05

Note： compared with the blank control group＊P<0.05; compared with the model control group▲P<0.05

2.2 自主活動情況

失眠模型組大鼠在移動距離、速度、中央區出現頻率和中央區停留時間上均高于空白對照組，其中在移動距離和速度上與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。表明失眠模型復制成功。經安神臍貼和地西泮治療后，移動距離和速度較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01)，在中央區出現頻率和在中央區停留時間也有所下降。見表2和圖1。

2.3 血清中GABA、NE含量測定

與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清中GABA含量明顯降低(P<0.01)，NE含量明顯升高(P<0.01)。經安神臍貼和地西泮治療后，大鼠血清中GABA含量顯著升高(P<0.01)，NE含量顯著下降(P<0.01)。見表3。

表2 安神臍貼對PCPA致失眠大鼠自主活動的影響Table 2 Effect of Anshen umbilical paste on autonomic activity in insomnia rats induced by

注：與空白對照組比較＊P<0.05；與模型對照組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01

Note： compared with the blank control group＊P<0.05; compared with the model control group▲P<0.05,▲▲P<0.01

圖1 各組大鼠自主活動軌跡圖注：A：空白對照組；B：模型對照組；C：安神臍貼組；D：地西泮組Fig.1 The autonomous activity track map of rats in each groupNote：A: blank control group； B: model control group； C: Anshen umbilical paste group； D: Diazepam group

組 別劑量/(g/kg)GABA/(μmol/L)NE/(ng/L)空白對照組—5.30±0.22107.87±5.41模型對照組—4.36±0.37??121.37±3.81??安神臍貼組2.705.27±0.39▲▲105.50±3.37▲▲地西泮組 0.90×10-35.52±0.32▲▲94.59±3.00▲▲

注：與空白對照組比較**P<0.01；與模型對照組比較▲▲P<0.01

Note： compared with the blank control group**P<0.01; compared with the model control group▲▲P<0.01

3 討論

失眠屬中醫“不寐”范疇，其病因病機可歸納為陰陽失交，陽不入陰，晝夜陰陽運轉失常，其病位在心，與肝、腎功能密切相關[3]。治療當以調節陰陽失衡，疏通經脈，恢復“陰平陽秘”為主[4]。安神臍貼是一種貼敷于臍部(神闕穴)的外用制劑，由朱砂、黃連、酸棗仁等組成，黃連能清心瀉火，酸棗仁可寧心安神，朱砂功專鎮驚安神，諸藥合用可奏清心瀉火、寧心安神、鎮驚安神之功。貼敷于神闕穴，即可通過透皮吸收發揮藥效，又可通過刺激神闕穴發揮穴效，雙效疊加用以調和氣血陰陽平衡，疏通經脈，從而達到“陰平陽秘”的目的[5]。現代醫學研究也表明，臍部表皮角質層薄，皮下靜脈網豐富，有利于藥物透過皮膚吸收，又可避免肝臟的代謝分解和消化道的降解破壞，從而更好地發揮藥效[6-7]。同時對神闕穴的刺激可調節人體的神經、體液平衡和免疫功能，促進人體恢復正常的生理功能。

本研究中安神臍貼可改善失眠模型大鼠的一般狀況，使其白天活動減少，睡眠時間延長，體質量明顯增加，與模型對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。在自主活動方面，失眠模型組大鼠在移動距離、速度、中央區出現頻率和中央區停留時間上均高于空白對照組，其中在移動距離和速度上與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。經安神臍貼治療后，移動距離和速度較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01)，在中央區出現頻率和在中央區停留時間也有所下降。表明安神臍貼能夠改善失眠模型大鼠的一般狀況和焦慮樣行為，有促眠作用。

大量臨床和實驗研究表明，失眠是一種由眾多神經遞質參與的神經調節過程[8]。GABA是重要的抑制性神經遞質，能抑制神經元活動和神經傳導，有助于睡眠[9]。本研究中模型組失眠大鼠血清中GABA含量明顯降低(P<0.01)，促眠作用減弱，大鼠出現失眠，白天也活動不停。經安神臍貼治療后，大鼠血清中GABA含量顯著升高(P<0.01)，說明安神臍貼能增加GABA的分泌，抑制覺醒和興奮，促進睡眠。NE是一種公認的參與覺醒的單胺類神經遞質[10]，其釋放量增加會引起交感神經系統活性增強，導致睡眠—覺醒紊亂，反之NE釋放量減少，產生正常睡眠[11]。本研究中模型組大鼠血清中NE含量明顯升高(P<0.01)，導致大鼠睡眠紊亂，經安神臍貼治療后，大鼠血清中NE含量顯著下降(P<0.01)，正常睡眠恢復。可見，神經遞質GABA和NE與睡眠—覺醒周期關系緊密，而安神臍貼改善睡眠作用的機制可能與增加GABA分泌，減少NE釋放，從而抑制神經元活動和神經傳導，減弱交感神經系統活性，維持睡眠—覺醒周期恒定有關。