MHC單倍體型無特定病原體鴨的培育*

王興童 孟 興 佟相慧 陳洪巖 韓凌霞

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物與比較醫學團隊，獸醫生物技術國家重點實驗室，黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室，哈爾濱 150069)

近交系實驗動物因其遺傳物質高度純合，生物學特性和免疫學水平穩定，試驗結果穩定，是開展生命科學和比較醫學研究的良好實驗材料，但是目前真正能滿足市場化供應的近交系實驗動物只有小鼠和大鼠，實驗動物資源匱乏，極大阻礙了生命科學研究進展。主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)是廣泛存在于脊椎動物染色質中的一個緊密連鎖、編碼多個免疫相關蛋白的基因簇。其核心基因的高度多態性與自身免疫病和有遺傳性相關的腫瘤免疫研究密切相關，是免疫遺傳學研究的重要靶基因簇。單倍體型(haplotype)實驗動物的遺傳特征介于近交系和封閉群之間，特定基因組片段純合的單倍體型實驗動物，是現階段實驗動物培育的重要方向。

無特定病原體(Specific pathogen free, SPF)鴨是重要的高等級禽類實驗動物，在禽病學、比較免疫學和水禽病的防控研究中發揮重要作用。中國和歐美都已培育成功并廣泛使用多個單倍體型SPF雞，但尚無單倍體型SPF鴨的報道。國家禽類實驗動物種子中心以地方品種紹興麻鴨 (Anasplatyrhynchosdomestica) 白殼I號為基礎經過屏障環境下的正壓隔離器飼養、物流人流阻斷污染途徑、飲用酸化水、飼喂60Co輻射無菌飼料等生物學凈化，以閉鎖群方式繁殖，實現了實驗動物化，命名為HBK-SPF鴨。經過6個世代的封閉繁育后，偏離Hardy-Weinberg平衡的位點減少，以等位基因數目為標志的群體遺傳多樣性下降，近交程度呈上升趨勢，但群體的雜合度相對穩定。經過分子遺傳學分析[1]、組織學分析[2]、疫病敏感性試驗[3]、細胞遺傳學分析[4]、解剖學數據測定[5]和生理生化數據[6]等多項生物學特性測定，已成為成熟、穩定的SPF鴨群，在禽流感疫苗的研制中發揮了無法替代的作用[7-13]。

鴨Tap1和Tap2兩個拷貝基因轉錄方向相反，Tap2毗鄰鴨MHC I類分子重鏈編碼基因UAA[14]。前期研究中，利用位于Tap基因的短串聯重復序列(Short tandem repeat, STR)多態性，在HBK-SPF鴨群檢測到4種純合基因型，以此建立了4個MHC單倍體型，分別稱為B1、B2、B3和B4[15]。為了檢測4個品系的遺傳穩定性，在連續4個世代分別開展了短串聯重復序列(STR)、基于Tap2 基因的肽結合區序列以及基于Tap2 全基因組序列的分子遺傳學分析，為MHC單倍型鴨群的遺傳質量監測提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

國家禽類實驗動物種子中心培育并保存的無特定病原體MHC單倍型 B1、B2、B3和B4 鴨(生產許可證編號為SCXK(黑)2011-007，使用許可證編號為SYXK(黑) 2011-022)。從出雛到淘汰，終生生活在正壓鴨專用隔離器，每日限飼60Co輻照滅菌飼料，飲水為酸化水，自由飲用。

1.2 樣品的制備及引物設計

無菌配制5% 檸檬酸鈉溶液，翅靜脈采集被檢鴨抗凝血。利用Omega Blood DNA Kit提取鴨外周血基因組總DNA，或者利用AxyPrepTMMultisource Total RNA Miniprep Kit提取鴨外周血總 RNA，Prime ScriptTMII1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄成cDNA。按照產品說明書，利用Nano Drop ND-1000濃度測定儀測定樣本質量，濃度及純度符合A260/A280=1.8～2.0的，-20 ℃備存。檢測所用的引物信息見表1，由哈爾濱博仕生物技術有限公司合成。

表1 PCR引物序列及產物信息Table 1 Information of primers and amplicon

1.3 F1代鴨Tap1基因組的短重復序列分型檢測

以F1代鴨的血液基因組DNA為模板，按照篩選F0代種鴨的方法，根據鴨Tap1基因組序列(登錄號為AY885227)中的短重復序列位點A(在MHC I區域的位置見圖1)進行分型。圖1中 UXA為MHC I類分子重鏈的編碼基因。B1、B2、B3和B4鴨各12羽、5羽、5羽和4羽。PCR反應體系為10× Taq buffer 2.0 μL，dNTP(2.5 mmol/μL)1. 0 μL, 引物AF1和AR1 (10 μmol/L) 各0.3 μL, 模板DNA (50 ng/μL)1.0 μL，Taq polymerase(2.5 U/μL)0.3 μL，加去離子水至20 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，59.4 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；最后再72 ℃延伸7 min。擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，分子量大小正確的送哈爾濱博仕生物公司測序。利用MEGA 6.0對序列結果與NCBI公布的AY885227和F0代鴨同時比較。

圖1 位點A與鴨MHC I分子重鏈編碼基因的相對位置示意圖[15]注：A表示短重復序列，箭頭表示轉錄方向Fig.1 The diagram of short tandem repeat sequence A with genes coding MHC I molecule heavy strainNote：A indicates a short repeat, and the arrow indicates the direction of transcription

1.4 F2代鴨TAP2 編碼區的同源性分析

以F2代B1、B2、B3鴨3羽、10羽和4羽的血液基因組RNA為模板，設計并合成鴨 TAP2蛋白編碼區特異性引物DuTAP2-F和DuTAP2-R，進行RT-PCR反應。按常規方法反轉錄。PCR反應程序為：95 ℃預變性 5 min；94 ℃ 變性 45 s，68 ℃退火2.5 min，循環 35 次；72 ℃延伸 10 min。針對Tap2基因組高變區設計并合成引物TAP-4(F)和TAP-4(R)，對F2代B4鴨18羽進行PCR擴增。取3 μL PCR 產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳，分子量大小正確的送哈爾濱博仕生物公司測序。

1.5 F3代鴨Tap2基因組序列的基因型分析

以F3代B2和B4鴨14羽和13羽的血液基因組DNA為模板，針對TAP2基因組序列的1nt-663 nt，設計鑒別引物D-TAP2-dF和D-TAP2-dR，見表1。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，分子量大小正確的送哈爾濱博仕生物公司測序。

2 結果

2.1 F1代單倍型鴨的檢測

根據序列比對結果，B1、B2、B3和B4鴨都存在短重復序列A位點，核心重復結構為GT，分別為(GT)14、(GT)11、(GT)9和(GT)17，各品系內在重復結構上游的108 nt區域(藍色下劃線)完全一致，且與F0代種鴨(圖中以B1 TAP1 gene表示，B2、B3和B4略同)分別完全同源；在下游的127 nt區域(綠色下劃線)，除B2內部及與F0代完全同源外，F1代的B1、B3和B4 分別出現12、6和10個堿基變異，每個位點都有2種等位基因。結果見圖2，數字表示F1代鴨的個體編號。

2.2 F2代單倍型鴨的檢測

根據Tap2完整編碼區和1～640 nt的高變區序列比對結果，表明F2代 3個B1系鴨(圖3中編號為4 113、4 124、41 34)品系內部完全一致，與F0代完全同源；10個B2系鴨(4 106、4 107、4 109、4 112、4 118、4 136、4 137、4 138、4 140和4 937)只在625位出現A和G 兩種等位基因(圖3中藍色框圖部分)。1～960nt區域的序列比對結果見圖3。

4個B3系鴨(編號為220、222、223、224)在1～640 nt的Tap2高變區呈高度多樣性，有24個位點存在2個等位基因，而B1、B2和B4均為單態。B3系鴨突變位點的基因型見表2。4個品系之間表現出明顯的型特異性。

2.3 F3代單倍型鴨的遺傳學分析

對F3代B2和B4鴨的Tap2 基因組1～663 nt的核苷酸序列與F0代進行比對，結果100%同源。

表2 F2代鴨TAP2 CDS區1～960 nt的突變位點及其等位基因Table 2 Mutation and alleles of Tap2 CDS 1-960 nt region of F2 haplotype ducks

3 討論

MHC區域是有頜生物基因組具有高度多樣性的區域，其基因緊密連鎖，是MHC單倍型建立的理論基礎。SPF鴨最初利用具有多態性的短重復序列作為MHC單倍型的分子標記，具體是根據上游108 nt、(GT)結構的重復數量以及下游127 nt的單核苷酸多態性，篩選出4種單倍型的F0代種鴨。為了檢測此單倍型鴨的遺傳穩定性，在后續連續3個世代，分別針對多樣性更高的Tap2 基因或基因組序列進行了遺傳學分析。

比對結果表明，雖然F1代B系鴨的短重復區序列及其上游側翼序列與F0代完全同源，但在下游的127 bp內，各品系都存在多個變異，且都有2個等位基因，表明根據A位點確定的純合個體在與其毗鄰的Tap2基因內還具有多態性。SPF鴨育種部門根據本檢測結果，將全部被測序列都同源的個體進行選育，剔除了下游存在多態性的個體。

在利用Tap2基因組序列對F2代的遺傳學檢測中，B1和B2系鴨已實現完全純合，但B3鴨出現24個變異點，且皆為2個等位基因。因此推測B3系鴨可能存在2種等位基因型。我們根據序列比對結果，將B3鴨分為B3-1和B3-2個亞群，分別保存、選育。

再次同時為了驗證B2和B4系鴨的純合型，在對F3代遺傳學檢測時，另外設計引物針對高變區進行比對，結果表明未再出現變異，說明B2和B4已實現穩定性純合。

眾所周知，動物的MHC的單倍型，包括Tap基因的等位基因型，與動物的多種疫病敏感性密切相關[16-18]。同樣，鴨的MHC單倍型也影響著不同品系鴨對禽流感[19]和鴨瘟[20]的致病性。本研究所選育的單倍型鴨，對F1代鴨人工感染鴨I型肝炎病毒，結果B2系鴨的死亡率(36%)明顯低于其他3個單倍型(73%～93%)[21]。利用表達 H5N1亞型禽流感病毒HA基因重組鴨瘟活載體疫苗免疫F2 代HBK-SPF雛鴨，9周的觀察中， B3系SPF 鴨的血凝抑制(HI)抗體效價始終顯著高于其它3個品系[22]。這些結果都暗示了鴨MHC可能影響了病原微生物對鴨病的致病性。

本研究為培育水禽疾病防控專用實驗動物提供了依據。